Bekämpningsmedel spelar en avgörande roll i att hantera global matbrist och bekämpa vektorburna mänskliga sjukdomar. Det växande problemet med bekämpningsmedelsresistens kräver dock snarast upptäckten av nya föreningar som riktar sig mot underutnyttjade mål. Insekts transienta receptorpotential (TRPV)-kanaler – Nanzhong (Nan) och inaktiva (Iav) – kan bilda heterologa kanaler (Nan-Iav) och lokaliseras till mekanosensoriska organ som medierar geotropism, hörsel och proprioception hos insekter. Vissa bekämpningsmedel, såsom aphidopyrrolidon (AP), riktar sig mot Nan-Iav genom okända mekanismer. AP är effektivt mot piercing-sugande insekter (hemipteraner) och förhindrar födointag genom att störa filamentens funktion. AP kan bara binda till Nan, men endast Nan-Iav kan interagera med agonister, inklusive endogen nikotinamid (NAM), och därigenom uppvisa kanalaktivitet. Trots Nan-Iavs potential som ett insekticidmål är lite känt om dess kanalsammansättning, regulatoriska bindningsställen och Ca2+-beroende reglering, vilket hindrar vidare insekticidutveckling. I denna studie användes kryoelektronmikroskopi för att bestämma strukturen av Nan-Iav hos Hemiptera-insekter i det kalmodulin-ligandfria tillståndet, såväl som med AP och NAM vid gränsen för den ankyrin-repeat cytoplasmatiska domänen (ARD). Överraskande nog fann vi att själva Nan-proteinet kan bilda en pentamer, vilken stabiliseras av AP-medierade ARD-interaktioner. Denna studie avslöjar molekylära interaktioner mellan insekticider och agonister och Nan-Iav, vilket belyser vikten av ARD i kanalfunktion och sammansättning, och utforskar mekanismen för Ca2+-reglering.
Mot bakgrund av allt allvarligare globala klimatförändringar är en försämrad global livsmedelssäkerhet en av 2000-talets största utmaningar, med omfattande konsekvenser för samhället.1,2Världshälsoorganisationens rapport State of Food Security and Nutrition in the World 2023 (SOFI) uppskattar att cirka 2,33 miljarder människor världen över lider av måttlig till svår osäker livsmedelsförsörjning, ett långvarigt problem.3,4Tyvärr förloras uppskattningsvis 20 % till 30 % eller mer av grödorna årligen på grund av skadedjur och patogener, och den globala uppvärmningen förväntas förvärra skadedjursresistens och grödors sårbarhet.4, 5, 6, 7, 8Utveckling av bekämpningsmedel är avgörande inte bara för att skydda grödor från skadedjur och minska spridningen av vektorburna patogener, utan också för att bekämpa vektorburna mänskliga sjukdomar som denguefeber, malaria och Chagas sjukdom, vilka blir alltmer resistenta mot bekämpningsmedel.5,9,10,11
Bland de viktigaste målen för neurotoxiska insekticider representerar den heterotetrameriska TRPV-kanalen Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) en klass av insekticidmål som upptäckts först under det senaste decenniet, inklusive kommersiellt tillgängliga insekticider såsom imidakloprid och pyraklostrobin.12,13,14Det semisyntetiska insekticidet aphidopyrrolifen (AP) är en nyligen utvecklad och kommersialiserad produkt vars huvudkomponent är det aktiva insekticidet Inscalis®, som binder AP vid en subnanomolär aktivitetsnivå.15AP uppvisar låg akut toxicitet för pollinatörer, nyttiga insekter och andra icke-målorganismer, och när det används enligt etikettinstruktionerna kan det minska resistenstrycket mot andra insekticider.16,17,18Nan och Iav är vitt spridda över insektsarter, uttrycks endast samtidigt i kordala stretchreceptorneuroner i antenner och extremiteter, och är avgörande för hörsel, gravitationsuppfattning och proprioception.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidakloprid och pyraklostrobin stimulerar Nan-Iav-komplexet genom en unik mekanism, vilket i slutändan hämmar proprioceptiv signaltransduktion.13,16,23Hos piercingsugande insekter (hemipteraner) som bladlöss och vitflugor försämrar förlust av proprioception deras förmåga att äta, vilket i slutändan leder till döden.13,24Intressant nog uppvisar AP hög affinitet för Nan-Iav-komplexet och låg affinitet för enbart Nan. Bindning av AP till Nan-Iav inducerar en elektrisk ström, men bindning till enbart Nan stimulerar inte kanalaktivitet. Iav i sig binder inte alls till AP.16Detta tyder på att Nan och Iav kan binda och bilda olika Nan-Iav-kanalkomplex (t.ex. med olika stökiometriska förhållanden eller olika arrangemang inom samma stökiometriska förhållande) eller att AP kan binda till flera ställen. Dessutom binder den naturliga agonisten nikotinamid (NAM) till Drosophila Nan-Iav med mikromolär affinitet, vilket uppvisar effekter som liknar dem hos bladlöss (AP) in vitro.16,25och hämmar bladlössens reproduktion och födointag, vilket i slutändan leder till deras död25,26Dessa data väcker många frågor. Till exempel är det fortfarande oklart hur Nan-Iav-heterodimeren bildas, vilka bindningsställen som används för att modulera små molekyler och hur dessa små molekyler reglerar kanalfunktionen genom att undertrycka proprioception. Dessutom är orsakerna till att Nan i sig är inaktivt och har låg affinitet för AP, medan Nan-Iav-heterodimeren är aktiv och binder AP med högre affinitet, oklara. Slutligen är lite känt om den Ca2+-beroende regleringen av Nan-Iav-funktionen och hur den integreras i neuronala signalprocesser.. 13,21
I denna studie, som kombinerade kryoelektronmikroskopi, elektrofysiologi och radioligandbindningstekniker, klargjorde vi sammansättningen av Nan-Iav och mekanismen för dess bindning till småmolekylära regulatorer. Dessutom detekterade vi konstitutivt bundet kalmodulin (CaM) till Iav och AP-stabiliserade Nan-pentamerer. Dessa resultat ger viktiga insikter i regleringen av kalciumjoner i kanaler, kanalsammansättning och de faktorer som bestämmer ligandbindningsaffinitet. Ännu viktigare är att vi bekräftade att ARD spelar en central roll i dessa processer. Vår studie av kompletta insektskanaler bundna till relevanta jordbruksbekämpningsmedel27, 28, 29öppnar upp möjligheter för utveckling av bekämpningsmedelsindustrin, förbättrar bekämpningsmedlens effektivitet och specificitet och möjliggör applicering av TRPV-riktade föreningar på andra arter för att hantera global livsmedelssäkerhet och spridningen av vektorburna sjukdomar.
Vi fann också att Nan-Iav regleras av Ca2+, och att regleringsmekanismen medieras av konstitutivt bundet CaM. Viktigt är att denna Ca2+-beroende reglering av Nav av CaM skiljer sig avsevärt från regleringsmekanismerna för andra jonkanaler (t.ex. spänningsstyrda Na+-kanaler och TRPV5/6-kanaler).52, 53, 54, 55, 56, 57I Nav1.2-kanalen associerar CaMs C-terminala domän spiralformigt med C-terminaldomänen (CTD), och Ca2+ inducerar bindning av dess N-terminala domän till den distala delen av CTD.56I TRPV5/6-kanalen binder CaM:s C-terminala domän till CTH, och Ca2+ inducerar en uppåtgående förlängning av dess N-terminala domän in i poren, vilket blockerar katjonpermeabilitet.53,54Vi föreslår en modell för den Ca2+-reglerade funktionen hos Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). I denna modell binder den N-terminala domänen hos CaM konstitutivt till den C-terminala domänen (CTH) hos Iav. I vilotillstånd (låg [Ca2+]-koncentration) interagerar den C-terminala domänen hos CaM med Nan, vilket stabiliserar ARD-konformationen och därigenom främjar kanalöppning. Bindning av en agonist/insekticid till kanalen inducerar poröppning, vilket leder till Ca2+-inflöde. Ca2+ binder sedan till CaM, vilket orsakar dissociation av den C-terminala domänen från ARD hos Nan. Eftersom blockering av CaM-bindning i huvudsak avskaffar den hämmande effekten av Ca2+, modulerar denna dissociation ARD-mobiliteten, vilket orsakar Ca2+-beroende hämning eller desensibilisering. Den snabba återhämtningen av kanalströmmar efter kalciumjoneluering (Fig. 4g) antyder att denna mekanism underlättar snabba svar på Ca2+-medierade neuronala signaler. Dessutom har det rapporterats att C-terminalregionen av Iav, som fortfarande är dåligt förstådd, spelar andra roller i kanalinriktning och nuvarande reglering.21
Slutligen presenterar vår studie den högupplösta strukturen hos ett insekticid-insekticid TRP-kanalkomplex av jordbruksmässig betydelse – en upptäckt som tidigare varit okänd för oss. Det är värt att notera att vi karakteriserade strukturen och funktionen hos insektskanalen i mänskliga celler (HEK293S GnTi–) snarare än i insektsceller. Mot bakgrund av växande insekticidresistens och fortsatt press på livsmedelssäkerhet och patogener ger vårt arbete viktig information som kommer att underlätta utvecklingen av nya insekticider till förmån för människors hälsa och global livsmedelssäkerhet. Studier har visat att insekticider som AP är effektiva mot vissa skadedjur när de används enligt etikettinstruktionerna och har låg akut toxicitet för nyttiga pollinatörer, vilket visar deras miljösäkerhet.13,16Dessutom har tester av vissa AP-derivat på myggor visat att de så småningom förlorar sin förmåga att flyga. Att förstå hur dessa modulerande föreningar binder till Nan-Iav kommer att underlätta modifiering av befintliga föreningar eller utveckling av nya föreningar för mer effektiva ochexaktskadedjursbekämpning. Vår studie visar att Nan-Iav ARD-gränssnittet är avgörande inte bara för att reglera aktiviteten hos endogena föreningar, bekämpningsmedel och Ca2+-CaM, utan även för kanalbildning. Vi föreslår att störning av heterodimerbildning med små molekyler kan vara en unik och lovande metod för att utveckla jonkanalhämmare.
Av de åtta ortologa generna valdes fullängdsgenerna från brunbaggenen (Halyomorpha halys) Nanchung och Inactive, vilka uppvisade utmärkt stabilitet i detergenter. De syntetiserade generna kodonoptimerades för mänskligt uttryck och klonades in i pBacMam pCMV-DEST-vektorn (Life Technologies) med hjälp av XhoI- och EcoRI-restriktionsställen. Detta säkerställde att klonerna var i linje med de C-terminala GFP-FLAG-10xHis- och mCherry-FLAG-10xHis-taggarna, vilka klyvs av HRC-3C-proteas (PPX), vilket möjliggör oberoende processer.uttryckPrimers som användes för att klona Nanchung och Inactive in i pBacMam-vektorn var följande:
Mikroskopiska bilder av individuella partiklar erhölls med ett Titan Krios G2 transmissionselektronmikroskop (FEI) utrustat med en K3-kamera och ett Gatan BioQuantum-energifilter. Mikroskopet användes vid 300 keV, med en energiinställning på 20 eV, en pixelstorlek på 1,08 Å/pixel (nominell förstoring på 81 000x) och en defokusgradient från -0,8 till -2,2 μm. Videoinspelning utfördes med 40 bilder per sekund med ett Latitude S-mikroskop (Gatan) med en nominell doshastighet på 25 e–px⁻¹ s⁻¹, en exponeringstid på 2,4 s och en total dos på cirka 60 e–Å⁻².
Strålinducerad rörelsekorrigering och dosviktning utfördes på film med MotionCor2 i RELION 4.061. Kontrastöverföringsfunktion (CTF) parameteruppskattning utfördes i cryoSPARC med hjälp av den patchbaserade CTF-uppskattningsmetoden62. Mikrofotografier med en CTF-anpassningsupplösning ≥4 Å exkluderades från efterföljande analys. Vanligtvis användes en delmängd av 500–1000 mikrofotografier för punktval i cryoSPARC, följt av flera omgångar av 2D-klassificering efter filtrering för att erhålla en tydlig referensbild för mallbaserat partikelval. Partiklarna extraherades sedan med hjälp av 64-pixel avgränsningsboxar och 4-faldig binning. Flera omgångar av 2D-klassificering utfördes för att ta bort oönskade partikelkategorier. Den initiala 3D-modellen rekonstruerades med hjälp av ab initio-rekonstruktion och förfinades med hjälp av icke-enhetlig förfining i cryoSPARC. 3D-klassificering utfördes i cryoSPARC eller RELION baserat på ARD-heterogenitet. Ingen signifikant heterogenitet av membrandomäner observerades. Partiklarna förfinades med hjälp av C1- och C2-metoderna; Partiklar med högre C2-upplösning ansågs symmetriska med avseende på C2 och importerades till RELION för Bayesiansk förfining. Partiklarna överfördes sedan tillbaka till cryoSPARC för slutlig icke-uniform och lokal förfining. Den slutliga upplösningen och partikelantalet visas i tabell 1.
Vid bearbetning av Nan+AP-pentamerer undersökte vi olika metoder för att förbättra upplösningen av membrandomäner (särskilt porregionen), såsom signalsubtraktion och TMD-maskering. Dessa försök misslyckades dock på grund av den potentiellt extrema oordningen i porregionen och den övergripande heterogeniteten hos TMD. Den slutliga upplösningen beräknades med hjälp av en mask som automatiskt genererades av den icke-uniforma bearbetningsmetoden i cryoSPARC, främst inriktad på ARD-regionen. Detta uppnådde signifikant högre upplösning än membrandomänernas (särskilt VSLD-regionen).
Initiala de novo-modeller av apo-formerna av Nanchung- och inaktiva buggar genererades först med hjälp av Coot63, och modeller av Nan- och Iav-buggarna genererades med hjälp av AlphaFold264 för att identifiera regioner med låg konfidens. Calmodulin-modellering baserades på stelkroppsanpassningar av Ca2+-bindande och Ca2+-fria modeller i PDB-accessioner 4JPZ56 respektive 1CFD65. Modellerna förfinades med hjälp av sfärisk förfining för att säkerställa korrekt stereokemi och god geometri. Fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin och fosfatidylserin modellerades sedan som väldefinierade lipiddensiteter, och NAM- och AP-liganderna placerades i motsvarande densiteter i de täta förbindelserna. Begränsningsfiler genererades från SMILES-strängen av isoformerna med hjälp av eLBOW i PHENIX66. Slutligen förfinades modellerna i verkliga rummet i PHENIX med hjälp av lokal rutnätssökning och global minimering med sekundära strukturbegränsningar. MolProbity-servern användes för modellförfining och strukturell analys, och illustrationer utfördes med PyMOL och UCSF Chimera X. 67,68,69 Aperturanalys utfördes med HOLE-servern,70 och sekvenskonserveringsmappning utfördes med Consurf-servern.71
Statistisk analys utfördes med Igor Pro 6.2, Excel Office 365 och GraphPad Prism 7.0. Alla kvantitativa data presenteras som medelvärde ± standardfel (SEM). Students t-test (tvåsidigt, oparat) användes för att jämföra två grupper. Envägsvariansanalys (ANOVA) följt av Dunnetts post hoc-test användes för att jämföra flera grupper. *P< 0,05, **P< 0,01 och ***P< 0,001 ansågs statistiskt signifikanta beroende på datafördelningen. Kd-, Ki-värden och deras asymmetriska 95 % konfidensintervall beräknades med hjälp av GraphPad Prism 10.
För mer information om studiens metodik, se sammanfattningen av Nature Portfolio Report som är länkad i den här artikeln.
Den initiala modellen byggdes med hjälp av kalmodulinmodellerna från PDB 4JPZ- och 1CFD-databaserna. Koordinaterna har deponerats i Protein Data Bank (PDB) under accessionsnummer 9NVN (Nan-Iav-CaM utan ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM bundet till nikotinamid), 9NVP (Nan-Iav-CaM bundet till nikotinamid och EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM bundet till afenidolpyrrollin och kalcium), 9NVR (Nan-Iav-CaM bundet till afenidolpyrrollin och EDTA) och 9NVS (Nan-pentamer bunden till afenidolpyrrollin). Motsvarande kryoelektronmikroskopibilder finns deponerade i Electron Microscopy Database (EMDB) under följande accessionsnummer: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM utan ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM-komplex med nikotinamid), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM-komplex med nikotinamid och EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM-komplex med afidopyrrollin och kalcium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM-komplex med afidopyrrollin och EDTA) och EMD-49849 (Nan-pentamerkomplex med afidopyrrollin). Rådata för funktionsanalysen presenteras i denna artikel.
Publiceringstid: 28 januari 2026