Det anthelmintiska läkemedlet N,N-dietyl-m-toluamid (DEET) har rapporterats hämma AChE (acetylkolinesteras) och har potentiella karcinogena egenskaper på grund av överdriven vaskularisering. I detta dokument visar vi att DEET specifikt stimulerar endotelceller som främjar angiogenes och därigenom ökar tumörtillväxten. DEET aktiverar cellulära processer som leder till angiogenes, inklusive proliferation, migration och adhesion. Detta är associerat med ökad NO-produktion och VEGF-uttryck i endotelceller. Tystnad av M3 eller användning av farmakologiska M3-hämmare avskaffade alla dessa effekter, vilket tyder på att DEET-inducerad angiogenes är M3-känslig. Experiment som involverar kalciumsignalering i endotel- och HEK-celler som överuttrycker M3-receptorer, såväl som bindnings- och dockningsstudier, indikerar att DEET fungerar som en allosterisk modulator av M3-receptorer. Vidare hämmar DEET AChE, vilket ökar biotillgängligheten av acetylkolin och dess bindning till M3-receptorer och förstärker proangiogena effekter genom allosterisk reglering.
Primära ECs isolerades från aorta hos schweiziska möss. Extraktionsmetoden anpassades från Kobayashi-protokollet 26 . Murina EC:er odlades i EBM-2-medium kompletterat med 5% värmeinaktiverad FBS fram till den fjärde passagen.
Effekten av två koncentrationer av DEET på proliferationen av HUVEC, U87MG eller BF16F10 analyserades med användning av CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Kortfattat såddes 5,103 celler per brunn i en 96-brunnars platta, fick fästa över natten och behandlades sedan med DEET i 24 timmar. Efter att ha tagit bort tillväxtmediet, tillsätt färgämnesbindande lösning till varje brunn på mikroplattan och inkubera cellerna vid 37 °C i 30 minuter. Fluorescensnivåer bestämdes med användning av en Mithras LB940 multimode mikroplattläsare (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland) utrustad med 485 nm excitationsfilter och 530 nm emissionsfilter.
HUVEC såddes i 96-brunnars plattor med en densitet av 104 celler per brunn. Celler behandlades med DEET i 24 timmar. Cellviabiliteten utvärderades med användning av en kolorimetrisk MTT-analys (Sigma-Aldrich, M5655). Optiska densitetsvärden erhölls på en multimods mikroplattläsare (Mithras LB940) vid en våglängd på 570 nm.
Effekterna av DEET studerades med användning av in vitro angiogenesanalyser. Behandling med 10-8 M eller 10-5 M DEET ökade bildandet av kapillärlängd i HUVECs (Fig. 1a, b, vita staplar). Jämfört med kontrollgruppen visade behandling med DEET-koncentrationer från 10-14 till 10-5 M att kapillärlängden nådde en platå vid 10-8 M DEET (kompletterande Fig. S2). Ingen signifikant skillnad hittades i den proangiogena effekten in vitro av HUVECs behandlade med DEET i koncentrationsintervallet 10-8 M och 10-5 M.
För att bestämma effekten av DEET på neovaskularisering utförde vi in vivo neovaskulariseringsstudier. Efter 14 dagar visade möss injicerade med endotelceller förodlade med 10-8 M eller 10-5 M DEET en signifikant ökning av hemoglobinhalten (Fig. 1c, vita staplar).
Vidare studerades DEET-inducerad neovaskularisering i U87MG xenograft-bärande möss som injicerades dagligen (ip) med DEET i en dos som är känd för att inducera plasmakoncentrationer på 10-5 M, vilket är normalt hos exponerade människor. i 23. Detekterbara tumörer (dvs. tumörer >100 mm3) observerades 14 dagar efter injektion av U87MG-celler i möss. På dag 28 ökade tumörtillväxten signifikant i DEET-behandlade möss jämfört med kontrollmöss (Fig. Id, rutor). Dessutom visade CD31-färgning av tumörer att DEET signifikant ökade kapillärarean men inte mikrokärldensiteten. (Fig. 1e–g).
För att bestämma rollen av muskarina receptorer i DETA-inducerad proliferation användes 10-8 M eller 10-5 M DETA i närvaro av pFHHSiD (10-7 M, en selektiv M3-receptorantagonist). Behandling av HUVEC. pFHHSiD blockerade fullständigt de proliferativa egenskaperna hos DETA vid alla koncentrationer (tabell 1).
Under dessa förhållanden undersökte vi också om DEET skulle öka kapillärlängden i HUVEC-celler. På liknande sätt förhindrade pFHHSiD signifikant DEET-inducerad kapillärlängd (Fig. 1a, b, grå staplar). Dessutom utfördes liknande experiment med M3 siRNA. Även om kontroll-siRNA inte var effektivt för att främja kapillärbildning, avskaffade tystnad av M3-muskarinreceptorn förmågan hos DEET att öka kapillärlängden (Fig. 1a, b, svarta staplar).
Dessutom blockerades både 10-8 M eller 10-5 M DEET-inducerad vaskularisering in vitro och neovaskularisering in vivo fullständigt av pFHHSiD (Fig. 1c, d, cirklar). Dessa resultat indikerar att DEET främjar angiogenes genom en väg som är känslig för selektiva M3-receptorantagonister eller M3-siRNA.
AChE är det molekylära målet för DEET. Läkemedel som donepezil, som fungerar som AChE-hämmare, kan stimulera EC-angiogenes in vitro och i musiska bakbensischemimodeller14. Vi testade effekten av två koncentrationer av DEET på AChE-enzymaktivitet i HUVEC. Låga (10-8 M) och höga (10-5 M) koncentrationer av DEET minskade endotelial AChE-aktivitet jämfört med kontrollförhållanden (fig. 2).
Båda koncentrationerna av DEET (10-8 M och 10-5 M) reducerade acetylkolinesterasaktivitet på HUVEC. BW284c51 (10-5 M) användes som kontroll för acetylkolinesterashämmare. Resultaten uttrycks som procent av AChE-aktivitet på HUVEC behandlad med de två koncentrationerna av DEET jämfört med vehikelbehandlade celler. Värden uttrycks som medelvärde ± SEM för sex oberoende experiment. *p < 0,05 jämfört med kontroll (Kruskal-Wallis och Dunn multipla jämförelsetest).
Kväveoxid (NO) är involverad i den angiogena processen 33, därför studerades NO-produktion i DEET-stimulerade HUVEC. DEET-behandlad endotelial NO-produktion ökade jämfört med kontrollceller, men nådde signifikans endast vid en dos av 10-8 M (Fig. 3c). För att bestämma de molekylära förändringarna som kontrollerar DEET-inducerad NO-produktion, analyserades eNOS-uttryck och aktivering med Western blotting. Även om DEET-behandling inte förändrade eNOS-uttryck, ökade den signifikant eNOS-fosforylering vid dess aktiverande ställe (Ser-1177) samtidigt som det minskade dess hämmande ställe (Thr-495) jämfört med obehandlade celler i eNOS-fosforylering (Fig. 3d). Vidare beräknades förhållandet mellan fosforylerad eNOS vid aktiveringsstället och inhiberingsstället efter normalisering av mängden fosforylerad eNOS till den totala mängden enzym. Detta förhållande ökade signifikant i HUVECs behandlade med varje koncentration av DEET jämfört med obehandlade celler (Fig. 3d).
Slutligen analyserades uttrycket av VEGF, en av de huvudsakliga proangiogena faktorerna, genom Western blotting. DEET ökade signifikant VEGF-uttryck, medan pFHHSiD fullständigt blockerade detta uttryck.
Eftersom effekterna av DEET är känsliga för både farmakologisk blockad och nedreglering av M3-receptorer, testade vi hypotesen att DEET kan förbättra kalciumsignaleringen. Överraskande nog misslyckades DEET med att öka cytoplasmatiskt kalcium i HUVEC (data visas inte) och HEK/M3 (Fig. 4a, b) för båda använda koncentrationerna.
Posttid: 2024-12-30