Det avmaskande läkemedlet N,N-dietyl-m-toluamid (DEET) har rapporterats hämma AChE (acetylkolinesteras) och har potentiellt cancerframkallande egenskaper på grund av överdriven vaskularisering. I denna artikel visar vi att DEET specifikt stimulerar endotelceller som främjar angiogenes, vilket ökar tumörtillväxt. DEET aktiverar cellulära processer som leder till angiogenes, inklusive proliferation, migration och adhesion. Detta är associerat med ökad NO-produktion och VEGF-uttryck i endotelceller. Tystning av M3 eller användning av farmakologiska M3-hämmare avskaffade alla dessa effekter, vilket tyder på att DEET-inducerad angiogenes är M3-känslig. Experiment som involverar kalciumsignalering i endotel- och HEK-celler som överuttrycker M3-receptorer, samt bindnings- och dockningsstudier, indikerar att DEET fungerar som en allosterisk modulator av M3-receptorer. Dessutom hämmar DEET AChE, vilket ökar biotillgängligheten av acetylkolin och dess bindning till M3-receptorer, och förstärker proangiogena effekter genom allosterisk reglering.
Primära EC:er isolerades från aorta hos schweiziska möss. Extraktionsmetoden anpassades från Kobayashi-protokollet 26. Murina EC:er odlades i EBM-2-medium kompletterat med 5 % värmeinaktiverat FBS fram till den fjärde passagen.
Effekten av två koncentrationer av DEET på proliferationen av HUVEC, U87MG eller BF16F10 analyserades med hjälp av CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Kortfattat såddes 5,10³ celler per brunn i en 96-brunnsplatta, fick fästa över natten och behandlades sedan med DEET i 24 timmar. Efter att tillväxtmediet tagits bort, tillsätts färgbindande lösning till varje brunn i mikroplattan och cellerna inkuberas vid 37 °C i 30 minuter. Fluorescensnivåerna bestämdes med hjälp av en Mithras LB940 multimodmikroplattläsare (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland) utrustad med 485 nm excitationsfilter och 530 nm emissionsfilter.
HUVEC såddes i 96-brunnsplattor med en densitet av 104 celler per brunn. Cellerna behandlades med DEET i 24 timmar. Cellviabiliteten bedömdes med hjälp av en kolorimetrisk MTT-analys (Sigma-Aldrich, M5655). Optiska densitetsvärden erhölls på en multimodmikroplattläsare (Mithras LB940) vid en våglängd av 570 nm.
Effekterna av DEET studerades med hjälp av in vitro-angiogenesanalyser. Behandling med 10⁻⁶ M eller 10⁻⁶ M DEET ökade bildandet av kapillärlängd i HUVEC (Fig. 1a, b, vita staplar). Jämfört med kontrollgruppen visade behandling med DEET-koncentrationer från 10⁻⁴ till 10⁻⁶ M att kapillärlängden nådde en platå vid 10⁻⁶ M DEET (kompletterande Fig. S2). Ingen signifikant skillnad hittades i den in vitro-proangiogena effekten av HUVEC behandlade med DEET i koncentrationsintervallet 10⁻⁶ M och 10⁻⁶ M.
För att fastställa effekten av DEET på neovaskularisering utförde vi neovaskulariseringsstudier in vivo. Efter 14 dagar uppvisade möss injicerade med endotelceller förodlade med 10⁻⁶ M eller 10⁻⁶ M DEET en signifikant ökning av hemoglobinhalten (Fig. 1c, vita staplar).
Vidare studerades DEET-inducerad neovaskularisering i U87MG xenograftbärande möss som injicerades dagligen (ip) med DEET i en dos känd för att inducera plasmakoncentrationer på 10⁻⁶ M, vilket är normalt hos exponerade människor. hos 23. Detekterbara tumörer (dvs. tumörer >100 mm3) observerades 14 dagar efter injektion av U87MG-celler i möss. Vid dag 28 var tumörtillväxten signifikant ökad hos DEET-behandlade möss jämfört med kontrollmöss (Fig. 1d, kvadrater). Vidare visade CD31-färgning av tumörer att DEET signifikant ökade kapillärarean men inte mikrokärlstätheten. (Fig. 1e–g).
För att fastställa muskarinreceptorernas roll i DETA-inducerad proliferation användes 10⁻⁶ M eller 10⁻⁶ M DETA i närvaro av pFHHSiD (10⁻⁶ M, en selektiv M3-receptorantagonist). Behandling av HUVEC. pFHHSiD blockerade fullständigt DETA:s proliferativa egenskaper vid alla koncentrationer (tabell 1).
Under dessa förhållanden undersökte vi också om DEET skulle öka kapillärlängden i HUVEC-celler. På liknande sätt förhindrade pFHHSiD signifikant DEET-inducerad kapillärlängd (Fig. 1a, b, grå staplar). Dessutom utfördes liknande experiment med M3 siRNA. Även om kontroll-siRNA:t inte var effektivt för att främja kapillärbildning, upphävde tystnaden av M3-muskarinreceptorn DEET:s förmåga att öka kapillärlängden (Fig. 1a, b, svarta staplar).
Dessutom blockerades både 10-8 M eller 10-5 M DEET-inducerad vaskularisering in vitro och neovaskularisering in vivo fullständigt av pFHHSiD (Fig. 1c, d, cirklar). Dessa resultat indikerar att DEET främjar angiogenes genom en signalväg som är känslig för selektiva M3-receptorantagonister eller M3 siRNA.
AChE är det molekylära målet för DEET. Läkemedel som donepezil, som fungerar som AChE-hämmare, kan stimulera EC-angiogenes in vitro och i musmodeller av bakbensischemi14. Vi testade effekten av två koncentrationer av DEET på AChE-enzymaktivitet i HUVEC. Låga (10⁻⁶ M) och höga (10⁻⁶ M) koncentrationer av DEET minskade endotelial AChE-aktivitet jämfört med kontrollförhållanden (Fig. 2).
Båda koncentrationerna av DEET (10⁻⁶ M och 10⁻⁶ M) minskade acetylkolinesterasaktiviteten på HUVEC. BW284c51 (10⁻⁶ M) användes som kontroll för acetylkolinesterashämmare. Resultaten uttrycks som procentandel av AChE-aktivitet på HUVEC behandlad med de två koncentrationerna av DEET jämfört med vehikelbehandlade celler. Värdena uttrycks som medelvärde ± SEM av sex oberoende experiment. *p < 0,05 jämfört med kontroll (Kruskal-Wallis och Dunn multipla jämförelsetest).
Kväveoxid (NO) är involverad i den angiogena processen 33, därför studerades NO-produktion i DEET-stimulerade HUVEC. DEET-behandlad endotelial NO-produktion ökade jämfört med kontrollceller, men nådde endast signifikans vid en dos på 10-8 M (Fig. 3c). För att bestämma de molekylära förändringarna som kontrollerar DEET-inducerad NO-produktion analyserades eNOS-uttryck och aktivering med Western blotting. Även om DEET-behandling inte förändrade eNOS-uttryck, ökade den signifikant eNOS-fosforyleringen vid dess aktiveringsställe (Ser-1177) samtidigt som den minskade dess hämmande ställe (Thr-495) jämfört med obehandlade celler i eNOS-fosforylering (Fig. 3d). Dessutom beräknades förhållandet mellan fosforylerad eNOS vid aktiveringsstället och hämmande stället efter normalisering av mängden fosforylerad eNOS till den totala mängden enzym. Detta förhållande ökade signifikant i HUVEC behandlade med varje koncentration av DEET jämfört med obehandlade celler (Fig. 3d).
Slutligen analyserades uttrycket av VEGF, en av de viktigaste proangiogena faktorerna, med Western blotting. DEET ökade signifikant VEGF-uttrycket, medan pFHHSiD helt blockerade detta uttryck.
Eftersom effekterna av DEET är känsliga för både farmakologisk blockad och nedreglering av M3-receptorer, testade vi hypotesen att DEET kan öka kalciumsignaleringen. Överraskande nog misslyckades DEET med att öka cytoplasmiskt kalcium i HUVEC (data visas ej) och HEK/M3 (Fig. 4a, b) för båda de koncentrationer som användes.
Publiceringstid: 30 dec 2024