I denna studie undersöktes de stimulerande effekterna av den kombinerade behandlingen avväxttillväxtregulatorer(2,4-D och kinetin) och järnoxid-nanopartiklar (Fe₃O₄-NP) på in vitro-morfogenes och sekundär metabolitproduktion i *Hypericum perforatum* L. undersöktes. Den optimerade behandlingen [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NP (4 mg/L)] förbättrade växternas tillväxtparametrar signifikant: växthöjden ökade med 59,6 %, rotlängden med 114,0 %, antalet knoppar med 180,0 % och kallusens färskvikt med 198,3 % jämfört med kontrollgruppen. Denna kombinerade behandling förbättrade också regenereringseffektiviteten (50,85 %) och ökade hypericinhalten med 66,6 %. GC-MS-analys visade höga halter av hyperosid, β-patolen och cetylalkohol, vilka stod för 93,36 % av den totala topparean, medan halterna av totala fenoler och flavonoider ökade med så mycket som 80,1 %. Dessa resultat indikerar att växttillväxtregulatorer (PGR) och Fe₃O₄-nanopartiklar (Fe₃O₄-NP) utövar en synergistisk effekt genom att stimulera organogenes och ackumulering av bioaktiva föreningar, vilket representerar en lovande strategi för bioteknologisk förbättring av medicinalväxter.
Johannesört (Hypericum perforatum L.), även känd som johannesört, är en flerårig örtartad växt i familjen Hypericaceae som har ekonomiskt värde.[1] Dess potentiellt bioaktiva komponenter inkluderar naturliga tanniner, xantoner, floroglucinol, naftalendiantron (hyperin och pseudohyperin), flavonoider, fenolsyror och eteriska oljor.[2,3,4] Johannesört kan förökas med traditionella metoder; dock begränsar säsongsvariationen hos traditionella metoder, låg frögroning och mottaglighet för sjukdomar dess potential för storskalig odling och kontinuerlig bildning av sekundära metaboliter.[1,5,6]
Därför anses in vitro-vävnadsodling vara en effektiv metod för snabb växtförökning, bevarande av groddplasmaresurser och ökat utbyte av medicinska föreningar [7, 8]. Växttillväxtregulatorer (PGR) spelar en avgörande roll i regleringen av morfogenes och är nödvändiga för in vitro-odling av kallus och hela organismer. Optimering av deras koncentrationer och kombinationer är avgörande för ett framgångsrikt slutförande av dessa utvecklingsprocesser [9]. Därför är det viktigt att förstå lämplig sammansättning och koncentration av regulatorer för att förbättra tillväxten och regenerativa kapaciteten hos johannesört (H. perforatum) [10].
Järnoxidnanopartiklar (Fe₃O₄) är en klass av nanopartiklar som har utvecklats eller håller på att utvecklas för vävnadsodling. Fe₃O₄ har betydande magnetiska egenskaper, god biokompatibilitet och förmågan att främja växttillväxt och minska miljöstress, så det har väckt stor uppmärksamhet inom vävnadsodlingsdesign. Potentiella tillämpningar av dessa nanopartiklar kan inkludera optimering av in vitro-odling för att främja celldelning, förbättra näringsupptaget och aktivera antioxidantenzymer [11].
Även om nanopartiklar har visat goda främjande effekter på växttillväxt, är studier av kombinerad applicering av Fe₃O₄-nanopartiklar och optimerade växttillväxtregulatorer i *H. perforatum* fortfarande sällsynta. För att fylla denna kunskapslucka utvärderade denna studie effekterna av deras kombinerade effekter på in vitro-morfogenes och sekundär metabolitproduktion för att ge nya insikter för att förbättra egenskaperna hos medicinalväxter. Därför har denna studie två mål: (1) optimera koncentrationen av växttillväxtregulatorer för att effektivt främja kallusbildning, skottregenerering och rotning in vitro; och (2) utvärdera effekterna av Fe₃O₄-nanopartiklar på tillväxtparametrar in vitro. Framtida planer inkluderar att utvärdera överlevnadsgraden för regenererade växter under acklimatisering (in vitro). Det förväntas att resultaten av denna studie avsevärt kommer att förbättra mikropropageringseffektiviteten hos *H. perforatum* och därigenom bidra till hållbar användning och biotekniska tillämpningar av denna viktiga medicinalväxt.
I denna studie erhöll vi bladexplantat från fältodlade ettåriga johannesörtsplantor (moderplantor). Dessa explantat användes för att optimera in vitro-odlingsförhållanden. Före odling sköljdes bladen noggrant under rinnande destillerat vatten i flera minuter. Explantatytorna desinficerades sedan genom nedsänkning i 70 % etanol i 30 sekunder, följt av nedsänkning i en 1,5 % natriumhypokloritlösning (NaOCl) innehållande några droppar Tween 20 i 10 minuter. Slutligen sköljdes explantaterna tre gånger med sterilt destillerat vatten innan de överfördes till nästa odlingsmedium.
Under de kommande fyra veckorna mättes parametrar för skottregenerering, inklusive regenereringshastighet, antal skott per explantat och skottlängd. När regenererade skott nådde en längd på minst 2 cm överfördes de till ett rotmedium bestående av halvstyrka MS-medium, 0,5 mg/L indolsmörsyra (IBA) och 0,3 % guargummi. Rotodlingen fortsatte i tre veckor, under vilken tid rotningshastighet, rotantal och rotlängd mättes. Varje behandling upprepades tre gånger, med 10 explantat odlade per replikat, vilket gav cirka 30 explantat per behandling.
Växthöjden mättes i centimeter (cm) med hjälp av en linjal, från plantans bas till toppen av det högsta bladet. Rotlängden mättes i millimeter (mm) omedelbart efter att plantorna försiktigt tagits bort och odlingsmediet tagits bort. Antalet knoppar per explantat räknades direkt på varje planta. Antalet svarta fläckar på bladen, så kallade knölar, mättes visuellt. Dessa svarta knölar tros vara körtlar som innehåller hypericin, eller oxidativa fläckar, och används som en fysiologisk indikator på växtens svar på behandlingen. Efter att allt odlingsmedium tagits bort mättes plantornas färskvikt med hjälp av en elektronisk våg med en noggrannhet på milligram (mg).
Metoden för att beräkna hastigheten för kallusbildning är följande: efter odling av explantat i ett medium innehållande olika tillväxtregulatorer (kinaser, 2,4-D och Fe3O4) i fyra veckor räknas antalet explantat som kan bilda kallus. Formeln för att beräkna hastigheten för kallusbildning är följande:
Varje behandling upprepades tre gånger, med minst 10 explantat undersökta i varje upprepning.
Regenereringshastigheten återspeglar andelen kallusvävnad som framgångsrikt fullbordar knoppdifferentieringsprocessen efter kallusbildningsstadiet. Denna indikator visar kallusvävnadens förmåga att omvandlas till differentierad vävnad och växa till nya växtorgan.
Rotningskoefficienten är förhållandet mellan antalet grenar som kan rota sig och det totala antalet grenar. Denna indikator återspeglar hur framgångsrikt rotningsstadiet är, vilket är avgörande för mikroförökning och växtförökning, eftersom god rotning hjälper plantor att bättre överleva under odlingsförhållanden.
Hypericinföreningar extraherades med 90 % metanol. Femtio mg torkat växtmaterial tillsattes till 1 ml metanol och sonikerades i 20 minuter vid 30 kHz i en ultraljudsrengörare (modell A5120-3YJ) vid rumstemperatur i mörker. Efter sonikering centrifugerades provet vid 6000 rpm i 15 minuter. Supernatanten samlades upp och absorbansen av hypericin mättes vid 592 nm med hjälp av en Plus-3000 S spektrofotometer enligt metoden som beskrivs av Conceiçao et al. [14].
De flesta behandlingar med växttillväxtregulatorer (PGR) och järnoxidnanopartiklar (Fe₃O₄-NP) inducerade inte bildning av svarta noduler på regenererade skottblad. Inga noduler observerades i någon av behandlingarna med 0,5 eller 1 mg/L 2,4-D, 0,5 eller 1 mg/L kinetin, eller 1, 2 eller 4 mg/L järnoxidnanopartiklar. Några få kombinationer visade en liten ökning av nodulutveckling (men inte statistiskt signifikant) vid högre koncentrationer av kinetin och/eller järnoxidnanopartiklar, såsom kombinationen av 2,4-D (0,5–2 mg/L) med kinetin (1–1,5 mg/L) och järnoxidnanopartiklar (2–4 mg/L). Dessa resultat visas i figur 2. Svarta noduler representerar hypericinrika körtlar, både naturligt förekommande och nyttiga. I denna studie var svarta noduler huvudsakligen associerade med brunfärgning av vävnader, vilket indikerar en gynnsam miljö för hypericinackumulering. Behandling med 2,4-D, kinetin och Fe₃O₄ nanopartiklar främjade kallustillväxt, minskad brunfärgning och ökat klorofyllinnehåll, vilket tyder på förbättrad metabolisk funktion och potentiell minskning av oxidativ skada [37]. Denna studie utvärderade effekterna av kinetin i kombination med 2,4-D och Fe₃O₄ nanopartiklar på tillväxten och utvecklingen av johannesörtskallus (Fig. 3a–g). Tidigare studier har visat att Fe₃O₄ nanopartiklar har svampdödande och antimikrobiella aktiviteter [38, 39] och, när de används i kombination med växttillväxtregulatorer, kan de stimulera växternas försvarsmekanismer och minska cellulära stressindex [18]. Även om biosyntesen av sekundära metaboliter är genetiskt reglerad, är deras faktiska utbyte starkt beroende av miljöförhållanden. Metaboliska och morfologiska förändringar kan påverka nivåerna av sekundära metaboliter genom att reglera uttrycket av specifika växtgener och reagera på miljöfaktorer. Dessutom kan inducerare utlösa aktiveringen av nya gener, vilket i sin tur stimulerar enzymatisk aktivitet, vilket i slutändan aktiverar flera biosyntetiska vägar och leder till bildandet av sekundära metaboliter. Vidare visade en annan studie att minskad skuggning ökar solljusexponeringen, vilket därigenom höjer dagstemperaturen i den naturliga livsmiljön för *Hypericum perforatum*, vilket också bidrar till ökat hypericinutbyte. Baserat på dessa data undersökte denna studie rollen av järnnanopartiklar som potentiella inducerare i vävnadsodling. Resultaten visade att dessa nanopartiklar kan aktivera gener involverade i hesperidinbiosyntes genom enzymatisk stimulering, vilket leder till ökad ackumulering av denna förening (Fig. 2). Jämfört med växter som växer under naturliga förhållanden kan man därför hävda att produktionen av sådana föreningar in vivo också kan förbättras när måttlig stress kombineras med aktivering av gener involverade i biosyntesen av sekundära metaboliter. Kombinationsbehandlingar har generellt en positiv effekt på regenereringshastigheten, men i vissa fall försvagas denna effekt. Det är värt att notera att behandling med 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinas och olika koncentrationer oberoende och signifikant kunde öka regenereringshastigheten med 50,85 % jämfört med kontrollgruppen (Fig. 4c). Dessa resultat tyder på att specifika kombinationer av nanohormoner kan verka synergistiskt för att främja växttillväxt och metabolitproduktion, vilket är av stor betydelse för vävnadsodling av medicinalväxter. Palmer och Keller [50] visade att 2,4-D-behandling oberoende kunde inducera kallusbildning i St. perforatum, medan tillsats av kinas signifikant förbättrade kallusbildning och regenerering. Denna effekt berodde på förbättringen av hormonbalansen och stimulering av celldelning. Bal et al. [51] fann att Fe₃O₄-NP-behandling oberoende kunde förbättra funktionen hos antioxidantenzymer och därigenom främja rottillväxt i St. perforatum. Odlingsmedier innehållande Fe₃O₄-nanopartiklar i koncentrationer av 0,5 mg/L, 1 mg/L och 1,5 mg/L förbättrade regenereringshastigheten hos linplantor [52]. Användningen av kinetin, 2,4-diklorbensotiazolinon och Fe₃O₄ nanopartiklar förbättrade kallus- och rotbildningshastigheterna avsevärt, men de potentiella biverkningarna av att använda dessa hormoner för in vitro-regenerering måste beaktas. Till exempel kan långvarig eller högkoncentrerad användning av 2,4-diklorbensotiazolinon eller kinetin resultera i somatisk klonal variation, oxidativ stress, onormal kallusmorfologi eller vitrifikation. Därför förutsäger en hög regenereringshastighet inte nödvändigtvis genetisk stabilitet. Alla regenererade växter bör bedömas med hjälp av molekylära markörer (t.ex. RAPD, ISSR, AFLP) eller cytogenetisk analys för att bestämma deras homogenitet och likhet med in vivo-växter [53,54,55].
Denna studie visade för första gången att kombinerad användning av växttillväxtregulatorer (2,4-D och kinetin) med Fe₃O₄-nanopartiklar kan förbättra morfogenesen och ackumuleringen av viktiga bioaktiva metaboliter (inklusive hypericin och hyperosid) i *Hypericum perforatum*. Den optimerade behandlingsregimen (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NP) maximerade inte bara kallusbildning, organogenes och utbyte av sekundära metaboliter, utan uppvisade också en mild inducerande effekt, vilket potentiellt förbättrar växtens stresstolerans och medicinska värde. Kombinationen av nanoteknik och växtvävnadskultur ger en hållbar och effektiv plattform för storskalig in vitro-produktion av medicinska föreningar. Dessa resultat banar väg för industriella tillämpningar och framtida forskning om molekylära mekanismer, doseringsoptimering och genetisk precision, och kopplar därmed samman grundläggande forskning om medicinalväxter med praktisk bioteknik.
Publiceringstid: 12 december 2025