Shoot apical meristem (SAM) tillväxt är avgörande för stamarkitektur. Växthormonergibberelliner(GA) spelar nyckelroller för att koordinera växttillväxt, men deras roll i SAM är fortfarande dåligt förstådd. Här utvecklade vi en ratiometrisk biosensor för GA-signalering genom att konstruera DELLA-proteinet för att undertrycka dess väsentliga regulatoriska funktion i GA-transkriptionssvaret samtidigt som dess nedbrytning vid GA-igenkänning bevaras. Vi visar att denna nedbrytningsbaserade biosensor korrekt registrerar förändringar i GA-nivåer och cellulär avkänning under utveckling. Vi använde denna biosensor för att kartlägga GA-signaleringsaktivitet i SAM. Vi visar att höga GA-signaler är närvarande främst i celler belägna mellan organprimordia, som är prekursorer till internodceller. Genom att använda tillvägagångssätt för förstärkning och förlust av funktion, visar vi vidare att GA reglerar orienteringen av celldelningsplanet, etablerar den kanoniska cellulära organisationen av internoder, och främjar därigenom internodspecifikation i SAM.
Skottets apikala meristemet (SAM), som ligger vid skottets spets, innehåller en nisch av stamceller vars aktivitet genererar sidoorgan och stamknutor på ett modulärt och iterativt sätt under växtens livstid. Var och en av dessa repeterande enheter, eller växtnoder, inkluderar internoder och laterala organ vid noderna, och axillära meristem i bladaxlarna1. Tillväxten och organisationen av växtnoder förändras under utvecklingen. I Arabidopsis undertrycks internodal tillväxt under det vegetativa stadiet, och axillära meristemer förblir vilande i axlarna på rosettblad. Under övergången till blomfasen blir SAM blomställningsmeristemet, vilket genererar långsträckta internoder och axillära knoppar, grenar i axlarna på blomkålsblad och senare bladlösa blommor2. Även om vi har gjort betydande framsteg i att förstå mekanismerna som styr initieringen av löv, blommor och grenar, är relativt lite känt om hur internoder uppstår.
Att förstå den spatiotemporala fördelningen av GA hjälper till att bättre förstå funktionerna hos dessa hormoner i olika vävnader och i olika utvecklingsstadier. Visualisering av nedbrytningen av RGA-GFP-fusion uttryckt under verkan av sin egen promotor ger viktig information om regleringen av totala GA-nivåer i rötter15,16. RGA-uttrycket varierar dock mellan vävnader17 och regleras av GA18. Således kan differentiellt uttryck av RGA-promotorn resultera i fluorescensmönstret som observeras med RGA-GFP och därför är denna metod inte kvantitativ. Mer nyligen avslöjade bioaktivt fluorescein (Fl)-märkt GA19,20 ackumuleringen av GA i rotendokortexen och regleringen av dess cellnivåer genom GA-transport. Nyligen visade GA FRET-sensorn nlsGPS1 att GA-nivåer korrelerar med cellförlängning i rötter, filament och mörkväxta hypokotyler21. Men som vi har sett är GA-koncentrationen inte den enda parametern som styr GA-signaleringsaktiviteten, eftersom den beror på komplexa avkänningsprocesser. Här, som bygger på vår förståelse av DELLA- och GA-signalvägarna, rapporterar vi utvecklingen och karakteriseringen av en nedbrytningsbaserad ratiometrisk biosensor för GA-signalering. För att utveckla denna kvantitativa biosensor använde vi en mutant GA-känslig RGA som fuserades till ett fluorescerande protein och uttrycktes allmänt i vävnader, såväl som ett GA-okänsligt fluorescerande protein. Vi visar att de mutanta RGA-proteinfusionerna inte stör endogen GA-signalering när de uttrycks överallt, och att denna biosensor kan kvantifiera signaleringsaktivitet som härrör från både GA-ingång och GA-signalbehandling av avkänningsapparaten med hög spatiotemporal upplösning. Vi använde denna biosensor för att kartlägga den spatiotemporala fördelningen av GA-signaleringsaktivitet och kvantifiera hur GA reglerar cellulärt beteende i SAM-epidermis. Vi visar att GA reglerar orienteringen av delningsplanet för SAM-celler belägna mellan organprimordia, och definierar därigenom internodens kanoniska cellulära organisation.
Slutligen frågade vi om qmRGA kunde rapportera förändringar i endogena GA-nivåer med hjälp av växande hypokotyler. Vi har tidigare visat att nitrat stimulerar tillväxt genom att öka GA-syntesen och i sin tur DELLA34-nedbrytning. Följaktligen observerade vi att hypokotyllängden i pUBQ10::qmRGA-plantor odlade under riklig nitrattillförsel (10 mM NO3-) var signifikant längre än i plantor som odlades under nitratbristförhållanden (kompletterande fig. 6a). I överensstämmelse med tillväxtsvaret var GA-signaler högre i hypokotyler hos plantor som odlats under 10 mM NO3−-förhållanden än i plantor som odlats i frånvaro av nitrat (kompletterande fig. 6b, c). Således möjliggör qmRGA också övervakning av förändringar i GA-signalering inducerade av endogena förändringar i GA-koncentration.
För att förstå om GA-signalaktiviteten som detekteras av qmRGA beror på GA-koncentration och GA-uppfattning, som förväntat baserat på sensordesignen, analyserade vi uttrycket av de tre GID1-receptorerna i vegetativa och reproduktiva vävnader. Hos plantor visade GID1-GUS-reporterlinjen att GID1a och c uttrycktes starkt i hjärtblad (Fig. 3a–c). Dessutom uttrycktes alla tre receptorerna i löv, laterala rotprimordia, rotspetsar (förutom rotkåpan på GID1b) och kärlsystemet (fig. 3a–c). I blomställningen SAM upptäckte vi GUS-signaler endast för GID1b och 1c (kompletterande fig. 7a–c). Hybridisering in situ bekräftade dessa uttrycksmönster och visade vidare att GID1c uttrycktes enhetligt vid låga nivåer i SAM, medan GID1b visade högre uttryck i periferin av SAM (kompletterande Fig. 7d-l). Den translationella fusionen pGID1b::2xmTQ2-GID1b avslöjade också ett graderat intervall av GID1b-uttryck, från lågt eller inget uttryck i mitten av SAM till högt uttryck vid organgränserna (kompletterande fig. 7m). Således är GID1-receptorer inte likformigt fördelade över och inom vävnader. I efterföljande experiment observerade vi också att överuttryck av GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ökade känsligheten av qmRGA i hypokotyler för extern GA-applikation (Fig. 3d, e). Däremot var fluorescens mätt med qd17mRGA i hypokotylen okänslig för GA3-behandling (Fig. 3f, g). För båda analyserna behandlades plantor med höga koncentrationer av GA (100 μM GA3) för att bedöma sensorns snabba beteende, där förmågan att binda till GID1-receptorn förbättrades eller förlorades. Tillsammans bekräftar dessa resultat att qmRGA-biosensorn tjänar en kombinerad funktion som en GA- och GA-sensor, och antyder att differentiellt uttryck av GID1-receptorn avsevärt kan modulera sensorns emissivitet.
Hittills är fördelningen av GA-signaler i SAM fortfarande oklar. Därför använde vi qmRGA-uttryckande växter och pCLV3::mCherry-NLS stamcellsreporter35 för att beräkna högupplösta kvantitativa kartor över GA-signalaktivitet, med fokus på L1-skiktet (epidermis; Fig. 4a, b, se Metoder och kompletterande metoder), eftersom L1 spelar en nyckelroll i SAM-tillväxt36. Här tillhandahöll pCLV3::mCherry-NLS-uttryck en fast geometrisk referenspunkt för att analysera den spatiotemporala fördelningen av GA-signaleringsaktivitet37. Även om GA anses vara väsentligt för laterala organutveckling4, observerade vi att GA-signaler var låga i det blommiga primordium (P) från och med P3-stadiet (Fig. 4a, b), medan unga P1- och P2-primordium hade måttlig aktivitet liknande den i den centrala regionen (Fig. 4a, b). Högre GA-signaleringsaktivitet detekterades vid organets primordiumgränser, med början vid P1/P2 (vid sidorna av gränsen) och toppade vid P4, såväl som i alla celler i den perifera regionen belägna mellan primordia (fig. 4a, b och kompletterande fig. 8a, b). Denna högre GA-signaleringsaktivitet observerades inte bara i epidermis utan även i L2- och övre L3-lagren (kompletterande fig. 8b). Mönstret av GA-signaler detekterade i SAM med qmRGA förblev också oförändrat över tiden (kompletterande fig. 8c–f, k). Även om qd17mRGA-konstruktionen systematiskt nedreglerades i SAM för T3-växter från fem oberoende linjer som vi karakteriserade i detalj, kunde vi analysera fluorescensmönstren som erhölls med pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstruktionen (kompletterande Fig. 8g-j, l). I denna kontrolllinje upptäcktes endast mindre förändringar i fluorescensförhållandet i SAM, men i SAM-centret observerade vi en tydlig och oväntad minskning av VENUS associerad med TagBFP. Detta bekräftar att signalmönstret som observeras av qmRGA återspeglar GA-beroende nedbrytning av mRGA-VENUS, men visar också att qmRGA kan överskatta GA-signaleringsaktivitet i meristemcentret. Sammanfattningsvis avslöjar våra resultat ett GA-signalmönster som främst återspeglar fördelningen av primordia. Denna fördelning av den interprimordiala regionen (IPR) beror på den gradvisa etableringen av hög GA-signaleringsaktivitet mellan det utvecklande primordiumet och det centrala området, samtidigt som GA-signaleringsaktiviteten i primordium minskar (fig. 4c, d).
Fördelningen av GID1b- och GID1c-receptorer (se ovan) tyder på att differentiellt uttryck av GA-receptorer hjälper till att forma mönstret av GA-signalaktivitet i SAM. Vi undrade om differentiell ackumulering av GA kunde vara inblandad. För att undersöka denna möjlighet använde vi nlsGPS1 GA FRET sensor21. Ökad aktiveringsfrekvens upptäcktes i SAM av nlsGPS1 behandlad med 10 μM GA4+7 i 100 min (kompletterande Fig. 9a–e), vilket indikerar att nlsGPS1 svarar på förändringar i GA-koncentrationen i SAM, som det gör i roots21. Rumslig fördelning av nlsGPS1-aktiveringsfrekvensen avslöjade relativt låga GA-nivåer i de yttre skikten av SAM, men visade att de var förhöjda i mitten och vid gränserna för SAM (fig. 4e och kompletterande fig. 9a,c). Detta tyder på att GA också distribueras i SAM med ett rumsligt mönster som är jämförbart med det som avslöjas av qmRGA. Som ett komplementärt tillvägagångssätt behandlade vi också SAM med fluorescerande GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) eller Fl enbart som en negativ kontroll. Fl-signalen fördelades över hela SAM, inklusive den centrala regionen och primordium, om än med en lägre intensitet (fig. 4j och kompletterande fig. 10d). Däremot ackumulerades alla tre GA-Fl specifikt inom primordiumgränserna och i varierande grad i resten av IPR, med GA7-Fl ackumulerade i den största domänen i IPR (fig. 4k och kompletterande fig. 10a,b). Kvantifiering av fluorescensintensitet avslöjade att intensitetsförhållandet IPR till icke-IPR var högre i GA-Fl-behandlad SAM jämfört med Fl-behandlad SAM (fig. 41 och tilläggsfig. 10c). Tillsammans tyder dessa resultat på att GA är närvarande i högre koncentrationer i IPR-celler som är belägna närmast organgränsen. Detta tyder på att mönstret för SAM GA-signaleringsaktivitet är resultatet av både differentiellt uttryck av GA-receptorer och differentiell ackumulering av GA i IPR-celler nära organgränser. Således avslöjade vår analys ett oväntat spatiotemporalt mönster av GA-signalering, med lägre aktivitet i mitten och primordium av SAM och högre aktivitet i IPR i den perifera regionen.
För att förstå rollen av differentiell GA-signaleringsaktivitet i SAM, analyserade vi korrelationen mellan GA-signaleringsaktivitet, cellexpansion och celldelning med hjälp av time-lapse-avbildning i realtid av SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Med tanke på GA:s roll vid tillväxtreglering förväntades en positiv korrelation med cellexpansionsparametrar. Därför jämförde vi först GA-signaleringsaktivitetskartor med kartor över cellytans tillväxthastighet (som en proxy för styrkan av cellexpansion för en given cell och för dotterceller vid delning) och med kartor över tillväxtanisotropi, som mäter riktningen av cellexpansion (används även här för en given cell och för dotterceller vid delning; Fig. 5a,b, se Metoder och kompletterande metoder). Våra kartor över SAM-cellytans tillväxthastighet överensstämmer med tidigare observationer38,39, med minimala tillväxthastigheter vid gränsen och maximala tillväxthastigheter i utvecklande blommor (Fig. 5a). Huvudkomponentanalys (PCA) visade att GA-signaleringsaktivitet var negativt korrelerad med cellytans tillväxtintensitet (Figur 5c). Vi visade också att huvudaxlarna för variation, inklusive GA-signalingång och tillväxtintensitet, var ortogonala mot den riktning som bestämdes av högt CLV3-uttryck, vilket bekräftar uteslutningen av celler från SAM-centret i de återstående analyserna. Spearman-korrelationsanalys bekräftade PCA-resultaten (Figur 5d), vilket indikerar att högre GA-signaler i IPR inte resulterade i högre cellexpansion. Korrelationsanalys avslöjade emellertid en lätt positiv korrelation mellan GA-signaleringsaktivitet och tillväxtanisotropi (Figur 5c, d), vilket tyder på att högre GA-signalering i IPR påverkar celltillväxtens riktning och möjligen positionen för celldelningsplanet.
a, b Värmekartor över genomsnittlig yttillväxt (a) och tillväxtanisotropi (b) i SAM i genomsnitt över sju oberoende växter (används som proxy för styrkan och riktningen för cellexpansion, respektive). c PCA-analys inkluderade följande variabler: GA-signal, yttillväxtintensitet, yttillväxtanisotropi och CLV3-expression. PCA-komponent 1 var huvudsakligen negativt korrelerad med yttillväxtintensitet och positivt korrelerad med GA-signal. PCA-komponent 2 var huvudsakligen positivt korrelerad med yttillväxtanisotropi och negativt korrelerad med CLV3-uttryck. Procentandelar representerar variationen som förklaras av varje komponent. d Spearman korrelationsanalys mellan GA-signal, yttillväxtintensitet och yttillväxtanisotropi vid vävnadsskalan exklusive CZ. Siffran till höger är Spearman rho-värdet mellan två variabler. Asterisker indikerar fall där korrelationen/negativa korrelationen är mycket signifikant. e 3D-visualisering av Col-0 SAM L1-celler med konfokalmikroskopi. Nya cellväggar som bildas i SAM (men inte primordium) vid 10 timmar färgas enligt deras vinkelvärden. Färgfältet visas i det nedre högra hörnet. Insättningen visar motsvarande 3D-bild vid 0 h. Experimentet upprepades två gånger med liknande resultat. f Boxplots visar celldelningshastigheter i IPR och icke-IPR Col-0 SAM (n = 10 oberoende anläggningar). Mittlinjen visar medianen, och rutagränserna indikerar 25:e och 75:e percentilen. Morrhår indikerar de lägsta och högsta värdena som bestämts med R-programvaran. P-värden erhölls med Welchs tvåsidiga t-test. g, h Schematiskt diagram som visar (g) hur man mäter vinkeln för den nya cellväggen (magenta) med avseende på den radiella riktningen från mitten av SAM (vit streckad linje) (endast spetsiga vinkelvärden, dvs 0–90°, beaktas), och (h) de perifera/laterala och radiella riktningarna inom meristem. i Frekvenshistogram av celldelningsplanets orientering över SAM (mörkblått), IPR (medelblått) respektive icke-IPR (ljusblått). P-värden erhölls genom ett tvåsidigt Kolmogorov-Smirnov-test. Experimentet upprepades två gånger med liknande resultat. j Frekvenshistogram över celldelningsplanets orientering av IPR runt P3 (ljusgrön), P4 (mellangrön) respektive P5 (mörkgrön). P-värden erhölls genom ett tvåsidigt Kolmogorov-Smirnov-test. Experimentet upprepades två gånger med liknande resultat.
Därför undersökte vi nästa korrelation mellan GA-signalering och celldelningsaktivitet genom att identifiera nybildade cellväggar under analysen (Fig. 5e). Detta tillvägagångssätt gjorde det möjligt för oss att mäta celldelningens frekvens och riktning. Överraskande nog fann vi att frekvensen av celldelningar i IPR och resten av SAM (icke-IPR, Fig. 5f) var liknande, vilket indikerar att skillnader i GA-signalering mellan IPR- och icke-IPR-celler inte signifikant påverkar celldelningen. Detta, och den positiva korrelationen mellan GA-signalering och tillväxtanisotropi, fick oss att överväga om GA-signaleringsaktivitet kunde påverka orienteringen av celldelningsplanet. Vi mätte orienteringen av den nya cellväggen som en spetsig vinkel i förhållande till den radiella axeln som förbinder meristemets centrum och centrum för den nya cellväggen (Fig. 5e-i) och observerade en tydlig tendens för celler att dela sig i vinklar nära 90° i förhållande till den radiella axeln, med de högsta frekvenserna observerade vid 80 09 %) och 0,20 % (80 %) och 0,20. (22,62%) (fig. 5e,i), motsvarande celldelningar i omkrets-/tvärriktningen (fig. 5h). För att undersöka bidraget från GA-signalering till detta celldelningsbeteende analyserade vi celldelningsparametrar i IPR och icke-IPR separat (Fig. 5i). Vi observerade att fördelningen av delningsvinkeln i IPR-celler skilde sig från den i icke-IPR-celler eller i celler i hela SAM, med IPR-celler som uppvisade en högre andel laterala/cirkulära celldelningar, dvs 70–80° och 80–90° (33,86% respektive 30,71%, motsvarande proportioner 5, Fig. Således avslöjade våra observationer ett samband mellan hög GA-signalering och en celldelningsplanorientering nära den periferiska riktningen, liknande korrelationen mellan GA-signaleringsaktivitet och tillväxtanisotropi (Fig. 5c, d). För att ytterligare fastställa den rumsliga bevarandet av denna förening, mätte vi delningsplanets orientering i IPR-celler som omger primordium med utgångspunkt från P3, eftersom den högsta GA-signaleringsaktiviteten upptäcktes i denna region med början från P4 (Fig. 4). Delningsvinklarna för IPR runt P3 och P4 visade inga statistiskt signifikanta skillnader, även om en ökad frekvens av laterala celldelningar observerades i IPR runt P4 (Fig. 5j). I IPR-cellerna runt P5 blev emellertid skillnaden i orienteringen av celldelningsplanet statistiskt signifikant, med en kraftig ökning av frekvensen av transversella celldelningar (Fig. 5j). Tillsammans tyder dessa resultat på att GA-signalering kan styra orienteringen av celldelningar i SAM, vilket överensstämmer med tidigare rapporter40,41 att hög GA-signalering kan inducera lateral orientering av celldelningar i IPR.
Det förutspås att celler i IPR inte kommer att inkorporeras i primordia utan snarare i internoder2,42,43. Den tvärgående orienteringen av celldelningar i IPR kan resultera i den typiska organisationen av parallella längsgående rader av epidermala celler i internoder. Våra observationer som beskrivs ovan tyder på att GA-signalering sannolikt spelar en roll i denna process genom att reglera celldelningens riktning.
Förlust av funktion hos flera DELLA-gener resulterar i ett konstitutivt GA-svar, och dellamutanter kan användas för att testa denna hypotes44. Vi analyserade först uttrycksmönstren för fem DELLA-gener i SAM. Transkriptionsfusion av GUS-linjen45 avslöjade att GAI, RGA, RGL1 och RGL2 (i mycket mindre utsträckning) uttrycktes i SAM (tilläggsbild 11a–d). Hybridisering in situ visade vidare att GAI-mRNA ackumuleras specifikt i primordia och utvecklande blommor (kompletterande fig. 11e). RGL1 och RGL3 mRNA detekterades i hela SAM baldakin och i äldre blommor, medan RGL2 mRNA var mer rikligt i gränsregionen (kompletterande Fig. 11f–h). Konfokal avbildning av pRGL3::RGL3-GFP SAM bekräftade uttrycket som observerades av in situ hybridisering och visade att RGL3-protein ackumuleras i den centrala delen av SAM (kompletterande fig. 11i). Genom att använda pRGA::GFP-RGA-linjen fann vi också att RGA-protein ackumuleras i SAM, men dess överflöd minskar vid gränsen med början från P4 (kompletterande Fig. 11j). Noterbart är uttrycksmönstren för RGL3 och RGA i överensstämmelse med högre GA-signaleringsaktivitet i IPR, som detekteras av qmRGA (Fig. 4). Dessutom indikerar dessa data att alla DELLA uttrycks i SAM och att deras uttryck kollektivt spänner över hela SAM.
Vi analyserade sedan celldelningsparametrarna i vildtyps-SAM (Ler, kontroll) och gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globala) mutanter (fig. 6a, b). Intressant nog observerade vi en statistiskt signifikant förändring i fördelningen av celldelningsvinkelfrekvenser i della global mutant SAM jämfört med vildtypen (Fig. 6c). Denna förändring i della global-mutanten berodde på en ökning av frekvensen av 80–90° vinklar (34,71% vs. 24,55%) och, i mindre utsträckning, 70–80° vinklar (23,78% vs. 20,18%), dvs motsvarande tvärgående celldelningar (Fig. 6c). Frekvensen av icke-tvärgående delningar (0–60°) var också lägre i den della globala mutanten (Fig. 6c). Frekvensen av transversella celldelningar ökade signifikant i SAM för den della globala mutanten (Fig. 6b). Frekvensen av transversella celldelningar i IPR var också högre i della global-mutanten jämfört med vildtypen (Fig. 6d). Utanför IPR-regionen hade vildtypen en mer enhetlig fördelning av celldelningsvinklar, medan della global-mutanten föredrog tangentiella divisioner som IPR (Fig. 6e). Vi kvantifierade också orienteringen av celldelningar i SAM för ga2-oxidas (ga2ox) femdubbla mutanter (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 och ga2ox6-2), en GA-inaktiv mutantbakgrund där GA ackumuleras. I överensstämmelse med ökningen av GA-nivåer var SAM för den femdubbla ga2ox-mutantblomställningen större än den för Col-0 (kompletterande Fig. 12a, b), och jämfört med Col-0, visade den femdubbla ga2ox SAM en distinkt annorlunda fördelning av celldelningsvinklar, med vinkelfrekvensen 500° till igen ökande vinkel 500°. indelningar (tilläggsbild 12a–c). Således visar vi att konstitutiv aktivering av GA-signalering och GA-ackumulering inducerar laterala celldelningar i IPR och resten av SAM.
a, b 3D-visualisering av L1-skiktet av PI-färgad Ler (a) och global dellamutant (b) SAM med hjälp av konfokalmikroskopi. Nya cellväggar som bildats i SAM (men inte primordium) under en 10-timmarsperiod visas och färgläggs enligt deras vinkelvärden. Insättningen visar SAM vid 0 h. Färgfältet visas i det nedre högra hörnet. Pilen i (b) pekar på ett exempel på justerade cellfiler i den globala dellamutanten. Experimentet upprepades två gånger med liknande resultat. ce-jämförelse av frekvensfördelningen av celldelningsplanorientering i hela SAM (d), IPR (e) och icke-IPR (f) mellan Ler och global della. P-värden erhölls med ett tvåsidigt Kolmogorov-Smirnov-test. f, g 3D-visualisering av konfokala bilder av PI-färgade SAM av Col-0 (i) och pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgena växter. Paneler (a, b) visar nya cellväggar (men inte primordia) bildade i SAM inom 10 timmar. Experimentet upprepades två gånger med liknande resultat. h–j Jämförelse av frekvensfördelningen av celldelningsplanorientering belägna i hela SAM (h), IPR (i) och icke-IPR (j) mellan Col-0 och pCUC2::gai-1-VENUS växter. P-värden erhölls med ett tvåsidigt Kolmogorov-Smirnov-test.
Vi testade sedan effekten av att hämma GA-signalering specifikt i IPR. För detta ändamål använde vi cotyledon cup 2 (CUC2)-promotorn för att driva uttryck av ett dominant negativt gai-1-protein sammansmält med VENUS (i pCUC2::gai-1-VENUS-linjen). I vildtyps-SAM driver CUC2-promotorn uttryck av de flesta IPR i SAM, inklusive gränsceller, från P4 och framåt, och liknande specifikt uttryck observerades i pCUC2::gai-1-VENUS-växter (se nedan). Fördelningen av celldelningsvinklar över SAM eller IPR för pCUC2::gai-1-VENUS-växter skilde sig inte signifikant från den för vildtypen, även om vi oväntat fann att celler utan IPR i dessa växter delade sig med en högre frekvens på 80–90 ° (Fig. 6f–j).
Det har föreslagits att celldelningens riktning beror på geometrin hos SAM, i synnerhet dragspänningen som genereras av vävnadens krökning46. Vi frågade därför om formen på SAM ändrades i della global mutant och pCUC2::gai-1-VENUS-växter. Som rapporterats tidigare12 var storleken på den della globala mutant SAM större än den för vildtypen (kompletterande figur 13a, b, d). Hybridisering in situ av CLV3 och STM RNA bekräftade meristemexpansionen i dellamutanter och visade vidare den laterala expansionen av stamcellsnisch (kompletterande fig. 13e, f, h, i). SAM-kurvaturen var emellertid likartad i båda genotyperna (kompletterande fig. 13k, m, n, p). Vi observerade en liknande ökning i storlek i gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della fyrdubbla mutanten utan en förändring i krökning jämfört med vildtypen (kompletterande figur 13c, d, g, j, l, o, p). Frekvensen av celldelningsorientering påverkades också i della fyrfaldiga mutanten, men i mindre utsträckning än i den della monolitiska mutanten (tilläggsbild 12d–f). Denna doseringseffekt, tillsammans med avsaknaden av en effekt på krökning, tyder på att kvarvarande RGL3-aktivitet i Della fyrfaldiga mutanten begränsar förändringar i celldelningsorientering orsakad av förlust av DELLA-aktivitet och att förändringar i laterala celldelningar inträffar som svar på förändringar i GA-signaleringsaktivitet snarare än förändringar i SAM-geometri. Som beskrivits ovan driver CUC2-promotorn IPR-uttryck i SAM med början vid P4 (tilläggsbild 14a, b), och i motsats härtill hade pCUC2::gai-1-VENUS SAM en minskad storlek men högre krökning (tilläggsbild 14c–h). Denna förändring i pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologi kan resultera i en annan fördelning av mekaniska spänningar jämfört med vildtypen, där höga omkretsspänningar börjar på ett kortare avstånd från SAM-centrum47. Alternativt kan förändringarna i pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologi vara resultatet av förändringar i regionala mekaniska egenskaper inducerade av transgenexpression48. I båda fallen kan detta delvis kompensera effekterna av förändringar i GA-signalering genom att öka sannolikheten för att celler delar sig i omkrets-/tvärriktningen, vilket förklarar våra observationer.
Sammantaget bekräftar våra data att högre GA-signalering spelar en aktiv roll i den laterala orienteringen av celldelningsplanet i IPR. De visar också att meristemkurvatur också påverkar orienteringen av celldelningsplanet i IPR.
Den tvärgående orienteringen av divisionsplanet i IPR, på grund av hög GA-signaleringsaktivitet, tyder på att GA förorganiserar en radiell cellfil i epidermis inom SAM för att definiera den cellulära organisation som senare kommer att hittas i den epidermala internoden. Sådana cellfiler var faktiskt ofta synliga i SAM-bilder av della globala mutanter (Fig. 6b). För att ytterligare utforska utvecklingsfunktionen hos det rumsliga mönstret för GA-signalering i SAM, använde vi time-lapse-avbildning för att analysera den rumsliga organisationen av celler i IPR i vildtyp (Ler och Col-0), della globala mutanter och pCUC2::gai-1-VENUS transgena växter.
Vi fann att qmRGA visade att GA-signaleringsaktiviteten i IPR ökade från P1/P2 och nådde en topp vid P4, och detta mönster förblev konstant över tiden (fig. 4a–f och kompletterande fig. 8c–f, k). För att analysera den rumsliga organisationen av celler i IPR med ökande GA-signal, märkte vi Ler IPR-celler ovanför och på sidorna av P4 enligt deras utvecklingsöde analyserade 34 timmar efter första observation, dvs mer än två plastidtider, vilket gör att vi kan följa IPR-celler under primordiumutveckling från P1/P2 till P4. Vi använde tre olika färger: gult för de celler som var integrerade i primordium nära P4, grönt för de som var i IPR och lila för de som deltog i båda processerna (Fig. 7a–c). Vid t0 (0 h) var 1–2 lager av IPR-celler synliga framför P4 (Fig. 7a). Som förväntat, när dessa celler delades, gjorde de det huvudsakligen via det tvärgående delningsplanet (fig. 7a–c). Liknande resultat erhölls med användning av Col-0 SAM (med fokus på P3, vars gränsveck på samma sätt som P4 i Ler), även om i denna genotyp vecket som bildades vid den blommiga gränsen gömde IPR-cellerna snabbare (fig. 7g-i). Således förorganiserar delingsmönstret för IPR-celler cellerna i radiella rader, som i internoder. Organisationen av radiella rader och lokaliseringen av IPR-celler mellan på varandra följande organ tyder på att dessa celler är internodala progenitorer.
Här utvecklade vi en ratiometrisk GA-signaleringsbiosensor, qmRGA, som möjliggör kvantitativ kartläggning av GA-signaleringsaktivitet som är ett resultat av kombinerade GA- och GA-receptorkoncentrationer samtidigt som interferens med endogena signalvägar minimeras, vilket ger information om GA-funktion på cellnivå. För detta ändamål konstruerade vi ett modifierat DELLA-protein, mRGA, som har förlorat förmågan att binda DELLA-interaktionspartners men förblir känsligt för GA-inducerad proteolys. qmRGA reagerar på både exogena och endogena förändringar i GA-nivåer, och dess dynamiska avkänningsegenskaper möjliggör bedömning av spatiotemporala förändringar i GA-signalaktivitet under utveckling. qmRGA är också ett mycket flexibelt verktyg eftersom det kan anpassas till olika vävnader genom att ändra promotorn som används för dess uttryck (om nödvändigt), och med tanke på den konserverade naturen hos GA-signalvägen och PFYRE-motivet över angiospermer, är det troligt att det kan överföras till andra arter22. I överensstämmelse med detta visades en ekvivalent mutation i ris SLR1 DELLA-proteinet (HYY497AAA) också undertrycka tillväxtrepressoraktiviteten hos SLR1 samtidigt som den endast minskade dess GA-medierade nedbrytning, liknande mRGA23. Nyligen genomförda studier i Arabidopsis visade att en enda aminosyramutation i PFYRE-domänen (S474L) förändrade transkriptionsaktiviteten hos RGA utan att påverka dess förmåga att interagera med transkriptionsfaktorpartners50. Även om denna mutation är mycket nära de 3 aminosyrasubstitutionerna som finns i mRGA, visar våra studier att dessa två mutationer förändrar distinkta egenskaper hos DELLA. Även om de flesta transkriptionsfaktorpartners binder till LHR1- och SAW-domänerna i DELLA26,51, kan vissa konserverade aminosyror i PFYRE-domänen hjälpa till att stabilisera dessa interaktioner.
Internodutveckling är en nyckelegenskap i växtarkitektur och avkastningsförbättring. qmRGA avslöjade högre GA-signaleringsaktivitet i IPR-internode progenitorceller. Genom att kombinera kvantitativ avbildning och genetik visade vi att GA-signalmönster överlagrar cirkulära/tvärgående celldelningsplan i SAM-epidermis, vilket formar celldelningsorganisationen som krävs för internodutveckling. Flera regulatorer av celldelningsplanorientering har identifierats under utveckling52,53. Vårt arbete ger ett tydligt exempel på hur GA-signaleringsaktivitet reglerar denna cellulära parameter. DELLA kan interagera med förveckningsproteinkomplex41, så GA-signalering kan reglera celldelningsplanets orientering genom att direkt påverka kortikala mikrotubulus orientering40,41,54,55. Vi visade oväntat att i SAM var korrelationen av högre GA-signaleringsaktivitet inte cellförlängning eller -delning, utan endast tillväxtanisotropi, vilket är förenligt med en direkt effekt av GA på celldelningens riktning i IPR. Vi kan dock inte utesluta att denna effekt också kan vara indirekt, till exempel medierad av GA-inducerad cellväggsmjukning56. Förändringar i cellväggsegenskaper inducerar mekanisk stress57,58, vilket också kan påverka orienteringen av celldelningsplanet genom att påverka orienteringen av kortikala mikrotubuli39,46,59. De kombinerade effekterna av GA-inducerad mekanisk stress och direkt reglering av mikrotubulus orientering av GA kan vara involverade i att generera ett specifikt mönster av celldelningsorientering i IPR för att definiera internoder, och ytterligare studier behövs för att testa denna idé. På liknande sätt har tidigare studier belyst vikten av de DELLA-interagerande proteinerna TCP14 och 15 i kontrollen av internodbildning60,61 och dessa faktorer kan mediera verkan av GA tillsammans med BREVIPEDICELLUS (BP) och PENNYWISE (PNY), som reglerar internodutveckling och har visat sig påverka,62GA-signalering2. Med tanke på att DELLA interagerar med signalvägar för brassinosteroid, etylen, jasmonsyra och abscisinsyra (ABA)63,64 och att dessa hormoner kan påverka mikrotubulus orientering65, kan effekterna av GA på celldelningsorienteringen också förmedlas av andra hormoner.
Tidiga cytologiska studier visade att både de inre och yttre områdena av Arabidopsis SAM krävs för internodutveckling2,42. Det faktum att GA aktivt reglerar celldelning i de inre vävnaderna12 stöder en dubbel funktion av GA för att reglera meristem och internodstorlek i SAM. Mönstret för riktad celldelning är också hårt reglerat i den inre SAM-vävnaden, och denna reglering är väsentlig för stamtillväxt52. Det ska bli intressant att undersöka om GA också spelar en roll för att orientera celldelningsplanet i den inre SAM-organisationen och därigenom synkronisera specifikationen och utvecklingen av internoder inom SAM.
Växter odlades in vitro i jord eller 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) kompletterat med 1% sackaros och 1% agar (Sigma) under standardförhållanden (16 timmar ljus, 22 °C), förutom hypokotyl- och rottillväxtexperiment där plantor odlades på vertikala plattor under konstant ljus och 22 °C. För nitratexperiment odlades plantor på modifierat MS-medium (bioWORLD-växtmedium) kompletterat med adekvat nitrat (0 eller 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinat, 1 % sackaros och 1 % A-agar (Sigma) under långa dagars förhållanden.
GID1a cDNA insatt i pDONR221 rekombinerades med pDONR P4-P1R-pUBQ10 och pDONR P2R-P3-mCherry i pB7m34GW för att generera pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2-DNA insatt i pDONR221 rekombinerades i pB7RWG266 för att generera p35S:IDD2-RFP. För att generera pGIDlb::2xmTQ2-GID1b amplifierades först ett 3,9 kb fragment uppströms om den GIDlb-kodande regionen och ett 4,7 kb fragment innehållande GIDlb cDNA (1,3 kb) och terminator (3,4 kb) med användning av primrarna i tilläggstabell 43 och sedan i PNRPrmo i PNR13. Fisher Scientific) respektive pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), och slutligen rekombinerade med pDONR221 2xmTQ268 till pGreen 012567-målvektorn med hjälp av Gateway-kloning. För att generera pCUC2::LSSmOrange, sattes CUC2-promotorsekvensen (3229 bp uppströms om ATG) följt av den kodande sekvensen av stora Stokes-skiftade mOrange (LSSmOrange)69 med N7-kärnlokaliseringssignalen och NOS-transkriptionsterminatorn in i pGreen-recombinet-målvektorn kanamybin-växelsystem för pGreenway-recom. (Invitrogen). Den binära växtvektorn infördes i Agrobacterium tumefaciens-stam GV3101 och introducerades i Nicotiana benthamiana-löven genom Agrobacterium-infiltrationsmetoden respektive i Arabidopsis thaliana Col-0 genom floral doppmetod. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry och pCLV3::mCherry-NLS qmRGA isolerades från F3- och F1-avkomlingarna av respektive korsningar.
RNA in situ-hybridisering utfördes på cirka 1 cm långa skottspetsar72, som samlades upp och omedelbart fixerades i FAA-lösning (3,7 % formaldehyd, 5 % ättiksyra, 50 % etanol) förkyld till 4 °C. Efter 2 x 15 min vakuumbehandlingar byttes fixativet och proverna inkuberades över natten. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 och RGL3 cDNA och antisensprober till deras 3'-UTR syntetiserades med användning av de primrar som visas i tilläggstabell 3 som beskrivs av Rosier et al.73. Digoxigeninmärkta sönder immundetekterades med hjälp av digoxigeninantikroppar (3000-faldig spädning; Roche, katalognummer: 11 093 274 910), och sektioner färgades med 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BCIP, 250-faldig diluet-BT, 250-faldigt diluet (N)/ 200-faldig spädning) lösning.
Posttid: 2025-02-10