Tillväxten av skottens apikala meristem (SAM) är avgörande för stamarkitekturen. Växthormonergibberelliner(GA) spelar nyckelroller i att koordinera växttillväxt, men deras roll i SAM är fortfarande dåligt förstådd. Här utvecklade vi en ratiometrisk biosensor för GA-signalering genom att konstruera DELLA-proteinet för att undertrycka dess väsentliga reglerande funktion i GA:s transkriptionssvar samtidigt som dess nedbrytning vid GA-igenkänning bevaras. Vi visar att denna nedbrytningsbaserade biosensor korrekt registrerar förändringar i GA-nivåer och cellulär avkänning under utveckling. Vi använde denna biosensor för att kartlägga GA-signaleringsaktivitet i SAM. Vi visar att höga GA-signaler huvudsakligen finns i celler belägna mellan organprimordier, vilka är föregångare till internodceller. Med hjälp av gain- och loss-of-function-metoder visar vi vidare att GA reglerar orienteringen av celldelningsplanet, vilket etablerar den kanoniska cellulära organisationen av internoder, och därigenom främjar internodspecifikation i SAM.
Skottspetsmeristemet (SAM), beläget vid skottspetsen, innehåller en nisch av stamceller vars aktivitet genererar laterala organ och stamnoder på ett modulärt och iterativt sätt under hela växtens livstid. Var och en av dessa upprepande enheter, eller växtnoder, inkluderar internoder och laterala organ vid noderna, och axillära meristem i bladvecken1. Tillväxten och organisationen av växtnoder förändras under utvecklingen. Hos Arabidopsis undertrycks internodtillväxten under det vegetativa stadiet, och axillära meristem förblir vilande i rosettbladens veckor. Under övergången till blomfasen blir SAM blomställningsmeristem, vilket genererar förlängda internoder och axillära knoppar, kvistar i axlarna på blombladen och senare bladlösa blommor2. Även om vi har gjort betydande framsteg i förståelsen av de mekanismer som styr initieringen av blad, blommor och grenar, är relativt lite känt om hur internoder uppstår.
Att förstå den spatiotemporala fördelningen av GA kommer att bidra till att bättre förstå dessa hormoners funktioner i olika vävnader och i olika utvecklingsstadier. Visualisering av nedbrytningen av RGA-GFP-fusion uttryckt under inverkan av dess egen promotor ger viktig information om regleringen av totala GA-nivåer i rötter15,16. RGA-uttryck varierar dock mellan vävnader17 och regleras av GA18. Således kan differentiellt uttryck av RGA-promotorn resultera i det fluorescensmönster som observeras med RGA-GFP och därför är denna metod inte kvantitativ. På senare tid avslöjade bioaktivt fluorescein (Fl)-märkt GA19,20 ackumuleringen av GA i rotens endokortex och regleringen av dess cellulära nivåer genom GA-transport. Nyligen visade GA FRET-sensorn nlsGPS1 att GA-nivåer korrelerar med cellförlängning i rötter, filament och mörkvuxna hypokotyler21. Men som vi har sett är GA-koncentration inte den enda parametern som styr GA-signaleringsaktivitet, eftersom den är beroende av komplexa avkänningsprocesser. Här, baserat på vår förståelse av DELLA- och GA-signalvägarna, rapporterar vi utvecklingen och karakteriseringen av en nedbrytningsbaserad ratiometrisk biosensor för GA-signalering. För att utveckla denna kvantitativa biosensor använde vi en mutant GA-känslig RGA som fusionerades till ett fluorescerande protein och uttrycktes ubikvitärt i vävnader, såväl som ett GA-okänsligt fluorescerande protein. Vi visar att de mutanta RGA-proteinfusionerna inte stör endogen GA-signalering när de uttrycks ubikvitärt, och att denna biosensor kan kvantifiera signalaktivitet som härrör från både GA-input och GA-signalbehandling av sensorn med hög spatiotemporal upplösning. Vi använde denna biosensor för att kartlägga den spatiotemporala fördelningen av GA-signalaktivitet och kvantifiera hur GA reglerar cellulärt beteende i SAM-epidermis. Vi visar att GA reglerar orienteringen av delningsplanet för SAM-celler belägna mellan organprimordier, och därigenom definierar den kanoniska cellulära organisationen av internoden.
Slutligen frågade vi om qmRGA kunde rapportera förändringar i endogena GA-nivåer med hjälp av växande hypokotyler. Vi visade tidigare att nitrat stimulerar tillväxt genom att öka GA-syntesen och i sin tur DELLA34-nedbrytningen. Följaktligen observerade vi att hypokotyllängden i pUBQ10::qmRGA-plantor odlade under riklig nitrattillförsel (10 mM NO3−) var signifikant längre än i plantor odlade under nitratbristfälliga förhållanden (kompletterande figur 6a). I överensstämmelse med tillväxtresponsen var GA-signalerna högre i hypokotyler hos plantor odlade under 10 mM NO3−-förhållanden än hos plantor odlade i frånvaro av nitrat (kompletterande figur 6b, c). Således möjliggör qmRGA också övervakning av förändringar i GA-signalering inducerad av endogena förändringar i GA-koncentrationen.
För att förstå huruvida GA-signaleringsaktiviteten som detekteras av qmRGA beror på GA-koncentration och GA-perception, vilket förväntas baserat på sensordesignen, analyserade vi uttrycket av de tre GID1-receptorerna i vegetativa och reproduktiva vävnader. Hos plantor visade GID1-GUS-reporterlinjen att GID1a och c uttrycktes i hög grad i hjärtblad (Fig. 3a–c). Dessutom uttrycktes alla tre receptorer i blad, laterala rotprimordier, rotspetsar (förutom rotmössan på GID1b) och kärlsystemet (Fig. 3a–c). I blomställnings-SAM detekterade vi endast GUS-signaler för GID1b och 1c (kompletterande Fig. 7a–c). In situ-hybridisering bekräftade dessa uttrycksmönster och visade vidare att GID1c uttrycktes enhetligt vid låga nivåer i SAM, medan GID1b visade högre uttryck i periferin av SAM (kompletterande Fig. 7d–l). Den translationella fusionen pGID1b::2xmTQ2-GID1b avslöjade också ett graderat intervall av GID1b-uttryck, från lågt eller inget uttryck i mitten av SAM till högt uttryck vid organgränserna (kompletterande figur 7m). Således är GID1-receptorer inte jämnt fördelade över och inom vävnader. I efterföljande experiment observerade vi också att överuttryck av GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ökade känsligheten hos qmRGA i hypokotyler för extern GA-applikation (figur 3d, e). Däremot var fluorescens mätt med qd17mRGA i hypokotylen okänslig för GA3-behandling (figur 3f, g). För båda analyserna behandlades plantorna med höga koncentrationer av GA (100 μM GA3) för att bedöma sensorns snabba beteende, där förmågan att binda till GID1-receptorn förbättrades eller förlorades. Tillsammans bekräftar dessa resultat att qmRGA-biosensorn tjänar en kombinerad funktion som en GA- och GA-sensor, och antyder att differentiellt uttryck av GID1-receptorn avsevärt kan modulera sensorns emissivitet.
Hittills är distributionen av GA-signaler i SAM fortfarande oklar. Därför använde vi qmRGA-uttryckande växter och pCLV3::mCherry-NLS stamcellsreportern35 för att beräkna högupplösta kvantitativa kartor över GA-signalaktivitet, med fokus på L1-lagret (epidermis; Fig. 4a, b, se Metoder och kompletterande metoder), eftersom L1 spelar en nyckelroll i att kontrollera SAM-tillväxt36. Här gav pCLV3::mCherry-NLS-uttryck en fast geometrisk referenspunkt för att analysera den spatiotemporala distributionen av GA-signalaktivitet37. Även om GA anses vara avgörande för lateral organutveckling4, observerade vi att GA-signalerna var låga i blomprimordiet (P) från P3-stadiet (Fig. 4a, b), medan unga P1- och P2-primordier hade måttlig aktivitet liknande den i den centrala regionen (Fig. 4a, b). Högre GA-signalaktivitet detekterades vid organets primordiumgränser, med början vid P1/P2 (vid sidorna av gränsen) och topp vid P4, såväl som i alla celler i den perifera regionen belägen mellan primordia (Fig. 4a, b och kompletterande Fig. 8a, b). Denna högre GA-signalaktivitet observerades inte bara i epidermis utan även i L2- och övre L3-skikten (kompletterande Fig. 8b). Mönstret av GA-signaler som detekterades i SAM med qmRGA förblev också oförändrat över tid (kompletterande Fig. 8c–f, k). Även om qd17mRGA-konstruktionen systematiskt nedreglerades i SAM hos T3-växter från fem oberoende linjer som vi karakteriserade i detalj, kunde vi analysera fluorescensmönstren som erhölls med pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstruktionen (kompletterande Fig. 8g–j, l). I denna kontrolllinje detekterades endast mindre förändringar i fluorescensförhållandet i SAM, men i SAM-centret observerade vi en tydlig och oväntad minskning av VENUS associerad med TagBFP. Detta bekräftar att signalmönstret som observeras av qmRGA återspeglar GA-beroende nedbrytning av mRGA-VENUS, men visar också att qmRGA kan överskatta GA-signalaktiviteten i meristemcentret. Sammanfattningsvis visar våra resultat ett GA-signalmönster som primärt återspeglar distributionen av primordier. Denna distribution av den inter-primordiala regionen (IPR) beror på den gradvisa etableringen av hög GA-signalaktivitet mellan det utvecklande primordiet och den centrala regionen, samtidigt som GA-signalaktiviteten i primordiet minskar (Fig. 4c, d).
Distributionen av GID1b- och GID1c-receptorer (se ovan) tyder på att differentiellt uttryck av GA-receptorer hjälper till att forma mönstret av GA-signaleringsaktivitet i SAM. Vi undrade om differentiell ackumulering av GA kan vara involverad. För att undersöka denna möjlighet använde vi nlsGPS1 GA FRET-sensorn21. Ökad aktiveringsfrekvens detekterades i SAM hos nlsGPS1 behandlad med 10 μM GA4+7 i 100 minuter (kompletterande figur 9a–e), vilket indikerar att nlsGPS1 reagerar på förändringar i GA-koncentrationen i SAM, precis som i rötter21. Spatial distribution av nlsGPS1-aktiveringsfrekvensen avslöjade relativt låga GA-nivåer i de yttre skikten av SAM, men visade att de var förhöjda i mitten och vid SAM:s gränser (figur 4e och kompletterande figur 9a, c). Detta tyder på att GA också är distribuerat i SAM med ett spatialmönster jämförbart med det som avslöjas av qmRGA. Som ett kompletterande tillvägagångssätt behandlade vi även SAM med fluorescerande GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) eller enbart Fl som negativ kontroll. Fl-signalen distribuerades i hela SAM, inklusive den centrala regionen och primordium, om än med en lägre intensitet (Fig. 4j och kompletterande Fig. 10d). Däremot ackumulerades alla tre GA-Fl specifikt inom primordiumgränserna och i varierande grad i resten av IPR, med GA7-Fl som ackumulerades i den största domänen i IPR (Fig. 4k och kompletterande Fig. 10a, b). Kvantifiering av fluorescensintensitet visade att förhållandet mellan IPR och icke-IPR-intensitet var högre i GA-Fl-behandlad SAM jämfört med Fl-behandlad SAM (Fig. 4l och kompletterande Fig. 10c). Tillsammans tyder dessa resultat på att GA finns i högre koncentrationer i IPR-celler som är belägna närmast organgränsen. Detta tyder på att mönstret av SAM GA-signaleringsaktivitet är ett resultat av både differentiellt uttryck av GA-receptorer och differentiell ackumulering av GA i IPR-celler nära organgränser. Vår analys avslöjade således ett oväntat spatiotemporalt mönster av GA-signalering, med lägre aktivitet i SAM:s centrum och primordium och högre aktivitet i IPR i den perifera regionen.
För att förstå rollen av differentiell GA-signaleringsaktivitet i SAM analyserade vi korrelationen mellan GA-signaleringsaktivitet, cellexpansion och celldelning med hjälp av realtids-timelapse-avbildning av SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Med tanke på GA:s roll i tillväxtreglering förväntades en positiv korrelation med cellexpansionsparametrar. Därför jämförde vi först kartor över GA-signaleringsaktivitet med kartor över cellytans tillväxthastighet (som en representation för styrkan i cellexpansionen för en given cell och för dotterceller vid delning) och med kartor över tillväxtanisotropi, vilket mäter riktningen av cellexpansionen (används även här för en given cell och för dotterceller vid delning; Fig. 5a, b, se Metoder och kompletterande metoder). Våra kartor över SAM-cellytans tillväxthastighet överensstämmer med tidigare observationer38,39, med minimala tillväxthastigheter vid gränsen och maximala tillväxthastigheter i utvecklande blommor (Fig. 5a). Principal component analysis (PCA) visade att GA-signaleringsaktivitet var negativt korrelerad med cellytans tillväxtintensitet (Figur 5c). Vi visade också att de huvudsakliga variationsaxlarna, inklusive GA-signaleringsinmatning och tillväxtintensitet, var ortogonala mot den riktning som bestämdes av högt CLV3-uttryck, vilket bekräftade exkluderingen av celler från SAM-centret i de återstående analyserna. Spearman-korrelationsanalys bekräftade PCA-resultaten (Figur 5d), vilket indikerar att högre GA-signaler i IPR inte resulterade i högre cellexpansion. Korrelationsanalysen visade dock en liten positiv korrelation mellan GA-signaleringsaktivitet och tillväxtanisotropi (Figur 5c, d), vilket tyder på att högre GA-signalering i IPR påverkar celltillväxtens riktning och möjligen positionen för celldelningsplanet.
a, b Värmekartor över genomsnittlig yttillväxt (a) och tillväxtanisotropi (b) i SAM i genomsnitt över sju oberoende plantor (användes som proxyvärden för styrkan respektive riktningen av cellexpansion). c PCA-analys inkluderade följande variabler: GA-signal, yttillväxtintensitet, yttillväxtanisotropi och CLV3-uttryck. PCA-komponent 1 var huvudsakligen negativt korrelerad med yttillväxtintensitet och positivt korrelerad med GA-signal. PCA-komponent 2 var huvudsakligen positivt korrelerad med yttillväxtanisotropi och negativt korrelerad med CLV3-uttryck. Procentandelar representerar variationen som förklaras av varje komponent. d Spearman-korrelationsanalys mellan GA-signal, yttillväxtintensitet och yttillväxtanisotropi på vävnadsskala exklusive CZ. Siffran till höger är Spearman Rho-värdet mellan två variabler. Asterisker indikerar fall där korrelationen/negativa korrelationen är mycket signifikant. e 3D-visualisering av Col-0 SAM L1-celler med konfokalmikroskopi. Nya cellväggar som bildats i SAM (men inte primordium) vid 10 timmar är färgade enligt deras vinkelvärden. Färgstapeln visas i det nedre högra hörnet. Infällningen visar motsvarande 3D-bild vid 0 timmar. Experimentet upprepades två gånger med liknande resultat. f Boxdiagram visar celldelningshastigheter i IPR och icke-IPR Col-0 SAM (n = 10 oberoende plantor). Mittlinjen visar medianen, och boxgränserna indikerar 25:e och 75:e percentilen. Morrhår indikerar minimi- och maximivärdena bestämda med R-programvara. P-värden erhölls med Welchs tvåsidiga t-test. g, h Schematiskt diagram som visar (g) hur man mäter vinkeln på den nya cellväggen (magenta) i förhållande till den radiella riktningen från SAM:s centrum (vit prickad linje) (endast spetsiga vinkelvärden, dvs. 0–90°, beaktas), och (h) de omkretsmässiga/laterala och radiella riktningarna inom meristemet. i Frekvenshistogram för celldelningsplanets orientering över SAM (mörkblå), IPR (mellanblå) respektive icke-IPR (ljusblå). P-värden erhölls med ett tvåsidigt Kolmogorov-Smirnov-test. Experimentet upprepades två gånger med liknande resultat. j Frekvenshistogram för celldelningsplanets orientering av IPR runt P3 (ljusgrön), P4 (mellangrön) respektive P5 (mörkgrön). P-värden erhölls med ett tvåsidigt Kolmogorov-Smirnov-test. Experimentet upprepades två gånger med liknande resultat.
Därför undersökte vi härnäst korrelationen mellan GA-signalering och celldelningsaktivitet genom att identifiera nybildade cellväggar under analysen (Fig. 5e). Denna metod gjorde det möjligt för oss att mäta frekvensen och riktningen för celldelningen. Överraskande fann vi att frekvensen av celldelningar i IPR och resten av SAM (icke-IPR, Fig. 5f) var likartad, vilket indikerar att skillnader i GA-signalering mellan IPR- och icke-IPR-celler inte signifikant påverkar celldelningen. Detta, och den positiva korrelationen mellan GA-signalering och tillväxtanisotropi, fick oss att överväga om GA-signaleringsaktivitet kunde påverka orienteringen av celldelningsplanet. Vi mätte orienteringen av den nya cellväggen som en spetsig vinkel i förhållande till den radiella axeln som förbinder meristemcentrum och centrum av den nya cellväggen (Fig. 5e-i) och observerade en tydlig tendens för celler att dela sig i vinklar nära 90° i förhållande till den radiella axeln, med de högsta frekvenserna observerade vid 70–80° (23,28%) och 80–90° (22,62%) (Fig. 5e,i), vilket motsvarar celldelningar i omkrets-/tvärriktningen (Fig. 5h). För att undersöka GA-signaleringens bidrag till detta celldelningsbeteende analyserade vi celldelningsparametrar i IPR och icke-IPR separat (Fig. 5i). Vi observerade att delningsvinkelfördelningen i IPR-celler skilde sig från den i icke-IPR-celler eller i celler i hela SAM, där IPR-celler uppvisade en högre andel laterala/cirkulära celldelningar, dvs. 70–80° och 80–90° (33,86 % respektive 30,71 %, motsvarande proportioner) (Fig. 5i). Således avslöjade våra observationer ett samband mellan hög GA-signalering och en celldelningsplanorientering nära omkretsriktningen, liknande korrelationen mellan GA-signaleringsaktivitet och tillväxtanisotropi (Fig. 5c, d). För att ytterligare fastställa den rumsliga konserveringen av denna association mätte vi delningsplanorienteringen i IPR-celler som omger primordiet med början från P3, eftersom den högsta GA-signaleringsaktiviteten detekterades i denna region med början från P4 (Fig. 4). Delningsvinklarna för IPR runt P3 och P4 visade inga statistiskt signifikanta skillnader, även om en ökad frekvens av laterala celldelningar observerades i IPR runt P4 (Fig. 5j). I IPR-cellerna runt P5 blev dock skillnaden i celldelningsplanets orientering statistiskt signifikant, med en kraftig ökning av frekvensen av transversella celldelningar (Fig. 5j). Tillsammans tyder dessa resultat på att GA-signalering kan kontrollera orienteringen av celldelningar i SAM, vilket överensstämmer med tidigare rapporter40,41 att hög GA-signalering kan inducera lateral orientering av celldelningar i IPR.
Det förutspås att celler i IPR inte kommer att införlivas i primordier utan snarare i internoder2,42,43. Den transversella orienteringen av celldelningar i IPR kan resultera i den typiska organisationen av parallella longitudinella rader av epidermala celler i internoder. Våra observationer som beskrivs ovan tyder på att GA-signalering sannolikt spelar en roll i denna process genom att reglera celldelningsriktningen.
Funktionsförlust hos flera DELLA-gener resulterar i ett konstitutivt GA-svar, och della-mutanter kan användas för att testa denna hypotes44. Vi analyserade först uttrycksmönstren för fem DELLA-gener i SAM. Transkriptionell fusion av GUS-linjen45 visade att GAI, RGA, RGL1 och RGL2 (i mycket mindre utsträckning) uttrycktes i SAM (kompletterande figur 11a–d). In situ-hybridisering visade vidare att GAI-mRNA ackumuleras specifikt i primordier och utvecklande blommor (kompletterande figur 11e). RGL1- och RGL3-mRNA detekterades i hela SAM-kronan och i äldre blommor, medan RGL2-mRNA var mer rikligt förekommande i kantregionen (kompletterande figur 11f–h). Konfokal avbildning av pRGL3::RGL3-GFP SAM bekräftade uttrycket som observerades genom in situ-hybridisering och visade att RGL3-protein ackumuleras i den centrala delen av SAM (kompletterande figur 11i). Med hjälp av pRGA::GFP-RGA-linjen fann vi också att RGA-protein ackumuleras i SAM, men dess förekomst minskar vid gränsen från P4 (kompletterande figur 11j). Det är värt att notera att uttrycksmönstren för RGL3 och RGA överensstämmer med högre GA-signaleringsaktivitet i IPR, vilket detekterats av qmRGA (figur 4). Dessutom indikerar dessa data att alla DELLA uttrycks i SAM och att deras uttryck kollektivt spänner över hela SAM.
Vi analyserade sedan celldelningsparametrarna i vildtyps-SAM (Ler, kontroll) och gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globala) mutanterna (Fig. 6a, b). Intressant nog observerade vi en statistiskt signifikant förändring i fördelningen av celldelningsvinkelfrekvenser i della global-mutanten SAM jämfört med vildtypen (Fig. 6c). Denna förändring i della global-mutanten berodde på en ökning av frekvensen av 80–90° vinklar (34,71% vs. 24,55%) och, i mindre utsträckning, 70–80° vinklar (23,78% vs. 20,18%), dvs. motsvarande transversella celldelningar (Fig. 6c). Frekvensen av icke-transversella delningar (0–60°) var också lägre i della global-mutanten (Fig. 6c). Frekvensen av transversella celldelningar ökade signifikant i SAM hos della global-mutanten (Fig. 6b). Frekvensen av transversella celldelningar i IPR var också högre i della global-mutanten jämfört med vildtypen (Fig. 6d). Utanför IPR-regionen hade vildtypen en mer enhetlig fördelning av celldelningsvinklar, medan della global-mutanten föredrog tangentiella delningar som IPR (Fig. 6e). Vi kvantifierade också orienteringen av celldelningar i SAM hos ga2-oxidas (ga2ox) femmutanter (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 och ga2ox6-2), en GA-inaktiv mutantbakgrund där GA ackumuleras. I överensstämmelse med ökningen av GA-nivåer var SAM för den femfaldiga ga2ox-mutantblomställningen större än för Col-0 (kompletterande figur 12a, b), och jämfört med Col-0 uppvisade den femfaldiga ga2ox SAM en tydligt annorlunda fördelning av celldelningsvinklar, med vinkelfrekvensen som ökade från 50° till 90°, dvs. återigen gynnande tangentiella delningar (kompletterande figur 12a–c). Således visar vi att konstitutiv aktivering av GA-signalering och GA-ackumulering inducerar laterala celldelningar i IPR och resten av SAM.
a, b 3D-visualisering av L1-lagret av PI-färgad Ler (a) och global della-mutant (b) SAM med hjälp av konfokalmikroskopi. Nya cellväggar som bildats i SAM (men inte primordium) under en 10-timmarsperiod visas och färgas enligt deras vinkelvärden. Infällningen visar SAM vid 0 timmar. Färgstapeln visas i det nedre högra hörnet. Pilen i (b) pekar på ett exempel på justerade cellfiler i den globala della-mutanten. Experimentet upprepades två gånger med liknande resultat. ce jämförelse av frekvensfördelningen av celldelningsplanorienteringar i hela SAM (d), IP R (e) och icke-IP R (f) mellan Ler och global della. P-värden erhölls med hjälp av ett tvåsidigt Kolmogorov-Smirnov-test. f, g 3D-visualisering av konfokala bilder av PI-färgad SAM från Col-0 (i) och pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgena växter. Panelerna (a, b) visar nya cellväggar (men inte primordier) som bildats i SAM inom 10 timmar. Experimentet upprepades två gånger med liknande resultat. h–j Jämförelse av frekvensfördelningen av celldelningsplanorienteringar belägna i hela SAM (h), IPR (i) och icke-IPR (j) mellan Col-0 och pCUC2::gai-1-VENUS-växter. P-värden erhölls med hjälp av ett tvåsidigt Kolmogorov–Smirnov-test.
Vi testade sedan effekten av att hämma GA-signalering specifikt i IPR. För detta ändamål använde vi cotyledon cup 2 (CUC2)-promotorn för att driva uttryck av ett dominant negativt gai-1-protein fusionerat till VENUS (i pCUC2::gai-1-VENUS-linjen). I vildtyp-SAM driver CUC2-promotorn uttryck av de flesta IPR i SAM, inklusive kantceller, från P4 och framåt, och liknande specifikt uttryck observerades i pCUC2::gai-1-VENUS-växter (se nedan). Fördelningen av celldelningsvinklar över SAM eller IPR hos pCUC2::gai-1-VENUS-växter skilde sig inte signifikant från vildtypens, även om vi oväntat fann att celler utan en IPR i dessa växter delade sig med en högre frekvens på 80–90° (Fig. 6f–j).
Det har föreslagits att celldelningsriktningen beror på SAM:s geometri, särskilt dragspänningen som genereras av vävnadens krökning46. Vi frågade därför om SAM:s form förändrades i della global-mutanten och pCUC2::gai-1-VENUS-plantorna. Som tidigare rapporterats12 var storleken på della global-mutanten SAM större än vildtypen (kompletterande figur 13a, b, d). In situ-hybridisering av CLV3 och STM RNA bekräftade meristemutationen i della-mutanter och visade vidare den laterala expansionen av stamcellsnischen (kompletterande figur 13e, f, h, i). SAM-krökningen var dock likartad i båda genotyperna (kompletterande figur 13k, m, n, p). Vi observerade en liknande ökning i storlek i gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della fyrdubbla mutanten utan en förändring i krökningen jämfört med vildtypen (kompletterande figur 13c, d, g, j, l, o, p). Frekvensen av celldelningsorientering påverkades också i della-kvadrupelmutanten, men i mindre utsträckning än i della-monolitiska mutanten (kompletterande figur 12d–f). Denna doseringseffekt, tillsammans med avsaknaden av effekt på krökning, tyder på att kvarvarande RGL3-aktivitet i Della-kvadrupelmutanten begränsar förändringar i celldelningsorientering orsakade av förlust av DELLA-aktivitet och att förändringar i laterala celldelningar sker som svar på förändringar i GA-signaleringsaktivitet snarare än förändringar i SAM-geometri. Som beskrivits ovan driver CUC2-promotorn IPR-uttryck i SAM med början vid P4 (kompletterande figur 14a, b), och däremot hade pCUC2::gai-1-VENUS SAM en minskad storlek men högre krökning (kompletterande figur 14c–h). Denna förändring i pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologin kan resultera i en annan fördelning av mekaniska påfrestningar jämfört med vildtypen, där höga omkretsspänningar börjar på ett kortare avstånd från SAM-centrumet . Alternativt kan förändringarna i pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologin bero på förändringar i regionala mekaniska egenskaper inducerade av transgenuttryck48. I båda fallen skulle detta delvis kunna motverka effekterna av förändringar i GA-signalering genom att öka sannolikheten för att cellerna kommer att dela sig i den cirkumferentiella/tvärgående orienteringen, vilket förklarar våra observationer.
Sammantaget bekräftar våra data att högre GA-signalering spelar en aktiv roll i den laterala orienteringen av celldelningsplanet i IPR. De visar också att meristemkrökning också påverkar orienteringen av celldelningsplanet i IPR.
Den transversella orienteringen av delningsplanet i IPR, på grund av hög GA-signaleringsaktivitet, tyder på att GA förorganiserar en radiell cellfil i epidermis inom SAM för att definiera den cellulära organisation som senare kommer att hittas i den epidermala internoden. Sådana cellfiler var faktiskt ofta synliga i SAM-bilder av della globala mutanter (Fig. 6b). För att ytterligare utforska den utvecklingsmässiga funktionen hos det rumsliga mönstret för GA-signalering i SAM, använde vi time-lapse-avbildning för att analysera den rumsliga organisationen av celler i IPR i vildtyps- (Ler och Col-0), della globala mutanter och pCUC2::gai-1-VENUS transgena växter.
Vi fann att qmRGA visade att GA-signalaktiviteten i IPR ökade från P1/P2 och nådde sin topp vid P4, och detta mönster förblev konstant över tid (Fig. 4a–f och kompletterande Fig. 8c–f, k). För att analysera den rumsliga organisationen av celler i IPR med ökande GA-signal, märkte vi Ler IPR-celler ovanför och på sidorna av P4 enligt deras utvecklingsöde analyserat 34 timmar efter den första observationen, dvs. mer än två plastidtider, vilket gör det möjligt för oss att följa IPR-celler under primordiumutveckling från P1/P2 till P4. Vi använde tre olika färger: gult för de celler som integrerades i primordium nära P4, grönt för de som befann sig i IPR och lila för de som deltog i båda processerna (Fig. 7a–c). Vid t0 (0 timmar) var 1–2 lager av IPR-celler synliga framför P4 (Fig. 7a). Som förväntat, när dessa celler delade sig, gjorde de det huvudsakligen via det tvärgående delningsplanet (Fig. 7a–c). Liknande resultat erhölls med Col-0 SAM (med fokus på P3, vars kant veckas på liknande sätt som P4 i Ler), även om i denna genotyp dolde vecket som bildades vid blomkanten IPR-cellerna snabbare (Fig. 7g–i). Således förorganiserar delningsmönstret för IPR-celler cellerna i radiella rader, som i internoder. Organisationen av radiella rader och lokaliseringen av IPR-celler mellan successiva organ tyder på att dessa celler är internodala föregångare.
Här utvecklade vi en ratiometrisk GA-signaleringsbiosensor, qmRGA, som möjliggör kvantitativ kartläggning av GA-signaleringsaktivitet som härrör från kombinerade GA- och GA-receptorkoncentrationer samtidigt som interferens med endogena signalvägar minimeras, vilket ger information om GA-funktion på cellnivå. För detta ändamål konstruerade vi ett modifierat DELLA-protein, mRGA, som har förlorat förmågan att binda till DELLA-interaktionspartner men fortfarande är känsligt för GA-inducerad proteolys. qmRGA reagerar på både exogena och endogena förändringar i GA-nivåer, och dess dynamiska avkänningsegenskaper möjliggör bedömning av spatiotemporala förändringar i GA-signaleringsaktivitet under utveckling. qmRGA är också ett mycket flexibelt verktyg eftersom det kan anpassas till olika vävnader genom att ändra promotorn som används för dess uttryck (om nödvändigt), och med tanke på den bevarade naturen hos GA-signaleringsvägen och PFYRE-motivet över angiospermer är det sannolikt att det är överförbart till andra arter22. I överensstämmelse med detta visades en ekvivalent mutation i ris-SLR1 DELLA-proteinet (HYY497AAA) också undertrycka tillväxtrepressoraktiviteten hos SLR1 samtidigt som den endast minskade dess GA-medierade nedbrytning något, liknande mRGA23. Det är värt att notera att nyligen genomförda studier i Arabidopsis visade att en enda aminosyramutation i PFYRE-domänen (S474L) förändrade den transkriptionella aktiviteten hos RGA utan att påverka dess förmåga att interagera med transkriptionsfaktorpartners50. Även om denna mutation är mycket nära de 3 aminosyrasubstitutionerna som finns i mRGA, visar våra studier att dessa två mutationer förändrar distinkta egenskaper hos DELLA. Även om de flesta transkriptionsfaktorpartners binder till LHR1- och SAW-domänerna i DELLA26,51, kan vissa konserverade aminosyror i PFYRE-domänen bidra till att stabilisera dessa interaktioner.
Internodutveckling är en viktig egenskap inom växtarkitektur och avkastningsförbättring. qmRGA avslöjade högre GA-signalaktivitet i IPR-internodprogenitorceller. Genom att kombinera kvantitativ avbildning och genetik visade vi att GA-signalmönster överlagrar cirkulära/tvärgående celldelningsplan i SAM-epidermis, vilket formar den celldelningsorganisation som krävs för internodutveckling. Flera regulatorer av celldelningsplanets orientering har identifierats under utvecklingen52,53. Vårt arbete ger ett tydligt exempel på hur GA-signalaktivitet reglerar denna cellulära parameter. DELLA kan interagera med förveckningsproteinkomplex41, så GA-signalering kan reglera celldelningsplanets orientering genom att direkt påverka kortikala mikrotubuliorientering40,41,54,55. Vi visade oväntat att i SAM var korrelatet för högre GA-signalaktivitet inte cellförlängning eller -delning, utan endast tillväxtanisotropi, vilket överensstämmer med en direkt effekt av GA på celldelningens riktning i IPR. Vi kan dock inte utesluta att denna effekt också kan vara indirekt, till exempel medierad av GA-inducerad cellväggsmjukgöring56. Förändringar i cellväggens egenskaper inducerar mekanisk stress57,58, vilket också kan påverka orienteringen av celldelningsplanet genom att påverka orienteringen av kortikala mikrotubuli39,46,59. De kombinerade effekterna av GA-inducerad mekanisk stress och direkt reglering av mikrotubuliorientering av GA kan vara involverade i att generera ett specifikt mönster av celldelningsorientering i IPR för att definiera internoder, och ytterligare studier behövs för att testa denna idé. På liknande sätt har tidigare studier belyst vikten av DELLA-interagerande proteiner TCP14 och 15 i kontrollen av internodbildning60,61 och dessa faktorer kan mediera GA:s verkan tillsammans med BREVIPEDICELLUS (BP) och PENNYWISE (PNY), vilka reglerar internodutveckling och har visat sig påverka GA-signalering2,62. Med tanke på att DELLA interagerar med signalvägar för brassinosteroider, etylen, jasmonsyra och abscisinsyra (ABA)63,64 och att dessa hormoner kan påverka mikrotubuliorientering65, kan effekterna av GA på celldelningsorientering också medieras av andra hormoner.
Tidiga cytologiska studier visade att både de inre och yttre regionerna av Arabidopsis SAM krävs för internodutveckling2,42. Det faktum att GA aktivt reglerar celldelning i de inre vävnaderna12 stöder en dubbel funktion av GA i att reglera meristem- och internodstorlek i SAM. Mönstret för riktad celldelning är också noggrant reglerat i den inre SAM-vävnaden, och denna reglering är avgörande för stamtillväxt52. Det ska bli intressant att undersöka om GA också spelar en roll i att orientera celldelningsplanet i den inre SAM-organisationen, och därigenom synkronisera specifikationen och utvecklingen av internoder inom SAM.
Växter odlades in vitro i jord eller 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) kompletterat med 1% sackaros och 1% agar (Sigma) under standardförhållanden (16 timmar ljus, 22 °C), förutom för hypokotyl- och rottillväxtexperiment där plantor odlades på vertikala plattor under konstant ljus och 22 °C. För nitratexperimenten odlades växterna på modifierat MS-medium (bioWORLD-växtmedium) kompletterat med tillräckligt med nitrat (0 eller 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinat, 1% sackaros och 1% A-agar (Sigma) under långdagsförhållanden.
GID1a-cDNA insatt i pDONR221 rekombinerades med pDONR P4-P1R-pUBQ10 och pDONR P2R-P3-mCherry in i pB7m34GW för att generera pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2-DNA insatt i pDONR221 rekombinerades in i pB7RWG266 för att generera p35S:IDD2-RFP. För att generera pGID1b::2xmTQ2-GID1b amplifierades först ett 3,9 kb fragment uppströms om GID1b-kodningsregionen och ett 4,7 kb fragment innehållande GID1b-cDNA (1,3 kb) och terminatorn (3,4 kb) med hjälp av primrarna i tilläggstabell 3 och infogades sedan i pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) respektive pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), och rekombinerades slutligen med pDONR221 2xmTQ268 in i pGreen 012567-målvektorn med hjälp av Gateway-kloning. För att generera pCUC2::LSSmOrange, monterades CUC2-promotorsekvensen (3229 bp uppströms om ATG) följt av kodningssekvensen för stor Stokes-skiftad mOrange (LSSmOrange)69 med N7-kärnlokaliseringssignalen och NOS-transkriptionsterminatorn i pGreen-kanamycin-målsökningsvektorn med hjälp av Gateway 3-fragmentrekombinationssystemet (Invitrogen). Den binära växtvektorn introducerades i Agrobacterium tumefaciens-stammen GV3101 och introducerades i Nicotiana benthamiana-blad med Agrobacterium-infiltrationsmetoden respektive i Arabidopsis thaliana Col-0 med blomdoppningsmetoden. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry och pCLV3::mCherry-NLS qmRGA isolerades från F3- respektive F1-avkommorna från respektive korsningar.
RNA in situ-hybridisering utfördes på ungefär 1 cm långa skottspetsar72, vilka samlades in och omedelbart fixerades i FAA-lösning (3,7 % formaldehyd, 5 % ättiksyra, 50 % etanol) förkylda till 4 °C. Efter 2 × 15 minuters vakuumbehandlingar byttes fixeringsmedlet och proverna inkuberades över natten. GID1a-, GID1b-, GID1c-, GAI-, RGL1-, RGL2- och RGL3-cDNA och antisensprober till deras 3'-UTR syntetiserades med hjälp av primrarna som visas i tilläggstabell 3 enligt beskrivningen av Rosier et al.73. Digoxigenin-märkta prober immunodetekterades med hjälp av digoxigenin-antikroppar (3000-faldig utspädning; Roche, katalognummer: 11 093 274 910), och snitt färgades med 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BCIP, 250-faldig utspädning)/nitroblått tetrazolium (NBT, 200-faldig utspädning) lösning.
Publiceringstid: 10 februari 2025