DELLA-proteiner är konserveradetillväxtregulatorersom spelar en central roll i växtutveckling som svar på interna och externa signaler. Som transkriptionsregulatorer binder DELLA till transkriptionsfaktorer (TF) och histon H2A via sina GRAS-domäner och rekryteras för att verka på promotorer. Nyligen genomförda studier har visat att DELLA-stabilitet regleras posttranslationellt av två mekanismer: polyubiquitinering inducerad av växthormonetgibberellin, vilket leder till deras snabba nedbrytning, och konjugering med liten ubiquitinliknande modifierare (SUMO), vilket ökar deras ackumulering. Dessutom regleras DELLA-aktivitet dynamiskt av två distinkta glykosyleringsmekanismer: O-fukosylering förstärker DELLA-TF-interaktion, medan O-länkad N-acetylglukosamin (O-GlcNAc)-modifiering hämmar DELLA-TF-interaktion. Emellertid är rollen för DELLA-fosforylering oklar eftersom tidigare studier har visat motstridiga resultat, där vissa tyder på att fosforylering främjar eller undertrycker DELLA-nedbrytning och andra tyder på att fosforylering inte påverkar deras stabilitet. Här identifierar vi fosforyleringsställen i GA1-3-repressorn (RGA), AtDELLA, renad från Arabidopsis thaliana genom masspektrometri och visar att fosforylering av två RGA-peptider i PolyS- och PolyS/T-regionerna förstärker RGA-aktivitet genom att främja H2A-bindning och RGA-association med målpromotorer. Det är värt att notera att fosforylering inte påverkade RGA-TF-interaktioner eller RGA-stabilitet. Vår studie avslöjar en molekylär mekanism genom vilken fosforylering inducerar DELLA-aktivitet.
Vår masspektrometriska analys visade att både Pep1 och Pep2 var höggradigt fosforylerade i RGA i den GA-bristfälliga Ga1-bakgrunden. Utöver denna studie har fosfoproteomiska studier också visat Pep1-fosforylering i RGA, även om dess roll ännu inte har studerats53,54,55. Däremot har Pep2-fosforylering inte beskrivits tidigare eftersom denna peptid endast kunde detekteras med hjälp av RGAGKG-transgenen. Även om m1A-mutationen, som avskaffade Pep1-fosforylering, endast något minskade RGA-aktiviteten i planta, hade den en additiv effekt i kombination med m2A för att minska RGA-aktiviteten (kompletterande figur 6). Viktigt är att Pep1-fosforyleringen var signifikant reducerad i den GA-förstärkta sly1-mutanten jämfört med ga1, vilket tyder på att GA främjar RGA-defosforylering och minskar dess aktivitet. Mekanismen genom vilken GA undertrycker RGA-fosforylering kräver ytterligare undersökning. En möjlighet är att detta uppnås genom reglering av ett oidentifierat proteinkinas. Även om studier har visat att uttrycket av CK1-proteinkinaset EL1 nedregleras av GA i ris41, indikerar våra resultat att högre ordningsmutationer av Arabidopsis EL1-homologen (AEL1-4) inte minskar RGA-fosforylering. I överensstämmelse med våra resultat identifierade en nyligen genomförd fosfoproteomisk studie med Arabidopsis AEL-överuttryckande linjer och en ael-trippelmutant inga DELLA-proteiner som substrat för dessa kinaser56. När vi förberedde manuskriptet rapporterades det att GSK3, genen som kodar för ett GSK3/SHAGGY-liknande kinas i vete (Triticum aestivum), kan fosforylera DELLA (Rht-B1b)57, även om fosforylering av Rht-B1b av GSK3 inte har bekräftats in planta. Enzymatiska reaktioner in vitro i närvaro av GSK3 följt av masspektrometrianalys avslöjade tre fosforyleringsställen belägna mellan DELLA- och GRAS-domänerna i Rht-B1b (kompletterande figur 3). Serin-alaninsubstitutioner vid alla tre fosforyleringsställena resulterade i minskad Rht-B1b-aktivitet i transgeniskt vete, vilket överensstämmer med våra resultat att alaninsubstitutioner i Pep2 RGA minskade RGA-aktiviteten. In vitro-proteinnedbrytningsanalyser visade dock vidare att fosforylering också kan stabilisera Rht-B1b57. Detta står i kontrast till våra resultat som visar att alaninsubstitutioner i Pep2 RGA inte förändrar dess stabilitet in planta. GSK3 i vete är en ortolog till brassinosteroid-okänsligt protein 2 (BIN2) i Arabidopsis57. BIN2 är en negativ regulator av BR-signalering, och BR aktiverar dess signalväg genom att orsaka BIN2-nedbrytning58. Vi visade att BR-behandling inte minskar RGA-stabilitet59 eller fosforyleringsnivåer i Arabidopsis (kompletterande figur 2), vilket tyder på att RGA sannolikt inte fosforyleras av BIN2.
Alla kvantitativa data analyserades statistiskt med hjälp av Excel, och signifikanta skillnader fastställdes med hjälp av Students t-test. Inga statistiska metoder användes för att förutbestämma urvalsstorleken. Inga data exkluderades från analysen; experimentet randomiserades inte; och forskarna var medvetna om fördelningen under experimentet och resultatbedömningen. Urvalsstorlekarna anges i figurtexterna och i rådatafilerna.
Publiceringstid: 15 april 2025