DELLA-proteiner är konserveradetillväxtregulatorersom spelar en central roll i växtutvecklingen som svar på interna och externa signaler. Som transkriptionsregulatorer binder DELLA till transkriptionsfaktorer (TFs) och histon H2A via sina GRAS-domäner och rekryteras för att agera på promotorer. Nyligen genomförda studier har visat att DELLA-stabilitet regleras post-translationellt av två mekanismer: polyubiquitination inducerad av växthormonetgibberellin, vilket leder till deras snabba nedbrytning, och konjugering med små ubiquitin-liknande modifierare (SUMO), vilket ökar deras ackumulering. Dessutom regleras DELLA-aktivitet dynamiskt av två distinkta glykosyleringsmekanismer: O-fukosylering förbättrar DELLA-TF-interaktion, medan O-kopplad N-acetylglukosamin (O-GlcNAc) modifiering hämmar DELLA-TF-interaktion. Rollen för DELLA-fosforylering är dock oklar eftersom tidigare studier har visat motstridiga resultat, där vissa tyder på att fosforylering främjar eller undertrycker DELLA-nedbrytning och andra tyder på att fosforylering inte påverkar deras stabilitet. Här identifierar vi fosforyleringsställen i GA1-3-repressorn (RGA), AtDELLA, renad från Arabidopsis thaliana genom masspektrometri och visar att fosforylering av två RGA-peptider i PolyS- och PolyS/T-regionerna förbättrar RGA-aktivitet genom att främja H2A-bindning och RGA-association med målpromotorer. Fosforylering påverkade inte RGA-TF-interaktioner eller RGA-stabilitet. Vår studie avslöjar en molekylär mekanism genom vilken fosforylering inducerar DELLA-aktivitet.
Vår masspektrometriska analys visade att både Pep1 och Pep2 var mycket fosforylerade i RGA i den GA-bristiga Ga1-bakgrunden. Förutom denna studie har fosfoproteomiska studier också avslöjat Pep1-fosforylering i RGA, även om dess roll ännu inte har studerats53,54,55. Däremot har Pep2-fosforylering inte beskrivits tidigare eftersom denna peptid endast kunde detekteras med användning av RGAGKG-transgenen. Även om m1A-mutationen, som avskaffade Pep1-fosforylering, endast något minskade RGA-aktiviteten i planta, hade den en additiv effekt när den kombinerades med m2A för att minska RGA-aktiviteten (kompletterande figur 6). Viktigt är att Pep1-fosforylering reducerades signifikant i den GA-förstärkta sly1-mutanten jämfört med ga1, vilket tyder på att GA främjar RGA-defosforylering, vilket minskar dess aktivitet. Mekanismen genom vilken GA undertrycker RGA-fosforylering kräver ytterligare undersökning. En möjlighet är att detta uppnås genom reglering av ett oidentifierat proteinkinas. Även om studier har visat att uttrycket av CK1-proteinkinaset EL1 nedregleras av GA i ris41, visar våra resultat att högre ordningens mutationer av Arabidopsis EL1-homologen (AEL1-4) inte minskar RGA-fosforylering. I överensstämmelse med våra resultat identifierade en nyligen genomförd fosfoproteomisk studie med Arabidopsis AEL-överuttryckande linjer och en ael trippelmutant inga DELLA-proteiner som substrat för dessa kinaser56. När vi förberedde manuskriptet rapporterades det att GSK3, genen som kodar för ett GSK3/SHAGGY-liknande kinas i vete (Triticum aestivum), kan fosforylera DELLA (Rht-B1b)57, även om fosforylering av Rht-B1b av GSK3 inte har bekräftats i planta. Enzymatiska reaktioner in vitro i närvaro av GSK3 följt av masspektrometrianalys avslöjade tre fosforyleringsställen belägna mellan DELLA- och GRAS-domänerna av Rht-B1b (kompletterande fig. 3). Serin till alaninsubstitutioner vid alla tre fosforyleringsställena resulterade i minskad Rht-B1b-aktivitet i transgent vete, i överensstämmelse med våra upptäckter att alaninsubstitutioner i Pep2 RGA minskade RGA-aktivitet. In vitro proteinnedbrytningsanalyser visade emellertid ytterligare att fosforylering också kan stabilisera Rht-B1b57. Detta står i motsats till våra resultat som visar att alaninsubstitutioner i Pep2 RGA inte förändrar dess stabilitet i planta. GSK3 i vete är en ortolog av brassinosteroid-okänsligt protein 2 (BIN2) i Arabidopsis 57. BIN2 är en negativ regulator av BR-signalering, och BR aktiverar dess signalväg genom att orsaka BIN2-nedbrytning 58. Vi visade att BR-behandling inte minskar RGA-stabilitet 59 eller arabidolementär fosforylpsi, figur 2, vilket tyder på att RGA sannolikt inte kommer att fosforyleras av BIN2.
Alla kvantitativa data analyserades statistiskt med hjälp av Excel, och signifikanta skillnader bestämdes med Students t-test. Inga statistiska metoder användes för att förbestämma provstorleken. Inga data exkluderades från analysen; experimentet var inte randomiserat; och forskarna var medvetna om tilldelningen under experimentet och resultatbedömningen. Provstorlekar finns i figurförklaringarna och i rådatafilerna.
Posttid: 2025-apr-15