Denna studie utvärderade letalitet, subletalitet och toxicitet hos kommersiellacypermetrinformuleringar till anuranska grodyngel. I det akuta testet testades koncentrationer på 100–800 μg/L i 96 timmar. I det kroniska testet testades naturligt förekommande cypermetrinkoncentrationer (1, 3, 6 och 20 μg/L) för mortalitet, följt av mikronukleustestning och kärnavvikelser i röda blodkroppar i 7 dagar. LC50 för den kommersiella cypermetrinformuleringen till grodyngel var 273,41 μg L−1. I det kroniska testet resulterade den högsta koncentrationen (20 μg L−1) i mer än 50 % mortalitet, eftersom den dödade hälften av de testade grodyngeln. Mikronukleustestet visade signifikanta resultat vid 6 och 20 μg L−1 och flera kärnavvikelser upptäcktes, vilket indikerar att den kommersiella cypermetrinformuleringen har genotoxisk potential mot P. gracilis. Cypermetrin är en hög risk för denna art, vilket indikerar att det kan orsaka flera problem och påverka dynamiken i detta ekosystem på kort och lång sikt. Därför kan man dra slutsatsen att kommersiella cypermetrinformuleringar har toxiska effekter på P. gracilis.
På grund av den kontinuerliga expansionen av jordbruksverksamhet och den intensiva tillämpningen avbekämpning av skadedjurGenom åtgärder utsätts vattenlevande djur ofta för bekämpningsmedel1,2. Föroreningar av vattenresurser nära jordbruksfält kan påverka utvecklingen och överlevnaden hos icke-målorganismer som amfibier.
Amfibier blir allt viktigare vid bedömningen av miljömatriser. Anuraner anses vara goda bioindikatorer för miljöföroreningar på grund av deras unika egenskaper såsom komplexa livscykler, snabb larvtillväxt, trofistatus, permeabel hud10,11, beroende av vatten för reproduktion12 och oskyddade ägg11,13,14. Den lilla vattengrodan (Physalaemus gracilis), allmänt känd som gråtgrodan, har visat sig vara en bioindikatorart för bekämpningsmedelsföroreningar4,5,6,7,15. Arten finns i stillastående vatten, skyddade områden eller områden med varierande livsmiljöer i Argentina, Uruguay, Paraguay och Brasilien1617 och anses vara stabil enligt IUCN-klassificeringen på grund av dess breda utbredning och tolerans för olika livsmiljöer18.
Subletala effekter har rapporterats hos amfibier efter exponering för cypermetrin, inklusive beteendemässiga, morfologiska och biokemiska förändringar hos grodyngel23,24,25, förändrad dödlighet och metamorfostid, enzymatiska förändringar, minskad kläckningsframgång24,25, hyperaktivitet26, hämning av kolinesterasaktivitet27 och förändringar i simförmåga7,28. Studier av de genotoxiska effekterna av cypermetrin hos amfibier är dock begränsade. Därför är det viktigt att bedöma anuranarters känslighet för cypermetrin.
Miljöföroreningar påverkar amfibiers normala tillväxt och utveckling, men den allvarligaste negativa effekten är genetiska skador på DNA orsakade av exponering för bekämpningsmedel13. Analys av blodkroppsmorfologi är en viktig bioindikator på föroreningar och potentiell toxicitet hos ett ämne för vilda arter29. Mikrokärntestet är en av de vanligaste metoderna för att bestämma genotoxiciteten hos kemikalier i miljön30. Det är en snabb, effektiv och billig metod som är en bra indikator på kemisk förorening av organismer som amfibier31,32 och kan ge information om exponering för genotoxiska föroreningar33.
Syftet med denna studie var att utvärdera den toxiska potentialen hos kommersiella cypermetrinformuleringar för små akvatiska grodyngel med hjälp av ett mikrokärntest och en ekologisk riskbedömning.
Kumulativ dödlighet (%) hos P. gracilis-grodyngel exponerade för olika koncentrationer av kommersiellt cypermetrin under testets akuta period.
Kumulativ dödlighet (%) hos P. gracilis-grodyngel exponerade för olika koncentrationer av kommersiellt cypermetrin under ett kroniskt test.
Den observerade höga dödligheten var ett resultat av genotoxiska effekter hos amfibier exponerade för olika koncentrationer av cypermetrin (6 och 20 μg/L), vilket framgår av förekomsten av mikrokärnor (MN) och kärnavvikelser i erytrocyter. Bildning av MN indikerar fel i mitosen och är förknippad med dålig bindning av kromosomer till mikrotubuli, defekter i proteinkomplex som ansvarar för kromosomupptag och transport, fel i kromosomsegregation och fel i reparation av DNA-skador38,39 och kan vara relaterade till bekämpningsmedelsinducerad oxidativ stress40,41. Andra avvikelser observerades vid alla utvärderade koncentrationer. Ökande cypermetrinkoncentrationer ökade kärnavvikelser i erytrocyter med 5 % respektive 20 % vid de lägsta (1 μg/L) respektive högsta (20 μg/L) doserna. Till exempel kan förändringar i en arts DNA få allvarliga konsekvenser för både kort- och långsiktig överlevnad, vilket resulterar i populationsminskning, förändrad reproduktiv kondition, inavel, förlust av genetisk mångfald och förändrade migrationshastigheter. Alla dessa faktorer kan påverka arters överlevnad och bibehållande42,43. Bildandet av erytroida avvikelser kan indikera ett block i cytokinesen, vilket resulterar i onormal celldelning (binukleära erytrocyter)44,45; multilobade kärnor är utsprång i kärnmembranet med flera lober46, medan andra erytroida avvikelser kan vara associerade med DNA-amplifiering, såsom nukleära njurar/blåsor47. Närvaron av anukleära erytrocyter kan indikera försämrad syretransport, särskilt i förorenat vatten48,49. Apoptos indikerar celldöd50.
Andra studier har också visat de genotoxiska effekterna av cypermetrin. Kabaña et al.51 demonstrerade förekomsten av mikrokärnor och kärnförändringar såsom binukleära celler och apoptotiska celler i Odontophrynus americanus-celler efter exponering för höga koncentrationer av cypermetrin (5000 och 10 000 μg L−1) i 96 timmar. Cypermetrininducerad apoptos detekterades också i P. biligonigerus52 och Rhinella arenarum53. Dessa resultat tyder på att cypermetrin har genotoxiska effekter på en rad vattenlevande organismer och att MN- och ENA-analysen kan vara en indikator på subletala effekter på amfibier och kan vara tillämplig på inhemska arter och vilda populationer som exponeras för gifter12.
Kommersiella formuleringar av cypermetrin utgör en hög miljörisk (både akut och kronisk), med HQ-värden som överstiger den amerikanska miljöskyddsmyndighetens (EPA) nivå54, vilket kan påverka arten negativt om den finns i miljön. I den kroniska riskbedömningen var NOEC för dödlighet 3 μg L−1, vilket bekräftar att koncentrationerna i vatten kan utgöra en risk för arten55. Den letala NOEC för R. arenarum-larver exponerade för en blandning av endosulfan och cypermetrin var 500 μg L−1 efter 168 timmar; detta värde minskade till 0,0005 μg L−1 efter 336 timmar. Författarna visar att ju längre exponeringen är, desto lägre är koncentrationerna som är skadliga för arten. Det är också viktigt att betona att NOEC-värdena var högre än de för P. gracilis vid samma exponeringstid, vilket indikerar att artens svar på cypermetrin är artspecifikt. Dessutom, vad gäller dödlighet, nådde CHQ-värdet för P. gracilis efter exponering för cypermetrin 64,67, vilket är högre än referensvärdet som fastställts av US Environmental Protection Agency54, och CHQ-värdet för R. arenarum-larver var också högre än detta värde (CHQ > 388,00 efter 336 timmar), vilket indikerar att de studerade insekticiden utgör en hög risk för flera amfibiearter. Med tanke på att P. gracilis behöver cirka 30 dagar för att fullborda metamorfosen56, kan man dra slutsatsen att de studerade koncentrationerna av cypermetrin kan bidra till populationsminskning genom att förhindra att infekterade individer går in i vuxen- eller reproduktionsstadiet i tidig ålder.
I den beräknade riskbedömningen av mikrokärnor och andra erytrocytkärnavvikelser varierade CHQ-värdena från 14,92 till 97,00, vilket indikerar att cypermetrin hade en potentiell genotoxisk risk för P. gracilis även i dess naturliga livsmiljö. Med hänsyn till dödligheten var den maximala koncentrationen av xenobiotiska föreningar som tolereras för P. gracilis 4,24 μg L−1. Emellertid visade koncentrationer så låga som 1 μg/L också genotoxiska effekter. Detta faktum kan leda till en ökning av antalet avvikande individer57 och påverka utvecklingen och reproduktionen av arter i deras livsmiljöer, vilket leder till en minskning av amfibiepopulationer.
Kommersiella formuleringar av insekticiden cypermetrin visade hög akut och kronisk toxicitet för P. gracilis. Högre dödlighet observerades, troligen på grund av toxiska effekter, vilket framgår av förekomsten av mikrokärnor och erytrocytkärnavvikelser, särskilt serrerade kärnor, lobiga kärnor och vesikulära kärnor. Dessutom uppvisade de studerade arterna ökade miljörisker, både akuta och kroniska. Dessa data, i kombination med tidigare studier av vår forskargrupp, visade att även olika kommersiella formuleringar av cypermetrin fortfarande orsakade minskad acetylkolinesteras (AChE) och butyrylkolinesteras (BChE) aktivitet och oxidativ stress58, och resulterade i förändringar i simaktivitet och orala missbildningar59 hos P. gracilis, vilket indikerar att kommersiella formuleringar av cypermetrin har hög letal och subletal toxicitet för denna art. Hartmann et al. 60 fann att kommersiella formuleringar av cypermetrin var de mest toxiska för P. gracilis och en annan art av samma släkte (P. cuvieri) jämfört med nio andra bekämpningsmedel. Detta tyder på att lagligt godkända koncentrationer av cypermetrin för miljöskydd kan leda till hög dödlighet och långsiktig populationsminskning.
Ytterligare studier behövs för att bedöma bekämpningsmedlets toxicitet för amfibier, eftersom de koncentrationer som finns i miljön kan orsaka hög dödlighet och utgöra en potentiell risk för P. gracilis. Forskning om amfibiearter bör uppmuntras, eftersom data om dessa organismer är knapphändiga, särskilt om brasilianska arter.
Testet för kronisk toxicitet varade i 168 timmar (7 dagar) under statiska förhållanden och de subletala koncentrationerna var: 1, 3, 6 och 20 μg ai L−1. I båda experimenten utvärderades 10 grodyngel per behandlingsgrupp med sex replikat, totalt 60 grodyngel per koncentration. Behandlingen med enbart vatten fungerade samtidigt som negativ kontroll. Varje experimentuppställning bestod av en steril glasskål med en kapacitet på 500 ml och en densitet på 1 grodyngel per 50 ml lösning. Kolven täcktes med polyetenfilm för att förhindra avdunstning och luftades kontinuerligt.
Vattnet analyserades kemiskt för att bestämma pesticidkoncentrationerna vid 0, 96 och 168 timmar. Enligt Sabin et al. 68 och Martins et al. 69 utfördes analyserna vid Pesticide Analysis Laboratory (LARP) vid Federal University of Santa Maria med hjälp av gaskromatografi kopplad till trippelkvadrupolmasspektrometri (Varian-modell 1200, Palo Alto, Kalifornien, USA). Kvantitativ bestämning av pesticider i vatten visas som kompletterande material (tabell SM1).
För mikrokärntestet (MNT) och testet för nukleär abnormitet i röda blodkroppar (RNA) analyserades 15 grodyngel från varje behandlingsgrupp. Grodyngeln sövdes med 5 % lidokain (50 mg g-170) och blodprover samlades in genom hjärtpunktion med hjälp av hepariniserade engångssprutor. Blodutdrag bereddes på sterila objektglas, lufttorkades, fixerades med 100 % metanol (4 °C) i 2 minuter och färgades sedan med 10 % Giemsa-lösning i 15 minuter i mörker. I slutet av processen tvättades objektglasen med destillerat vatten för att avlägsna överflödig färg och torkades i rumstemperatur.
Minst 1000 röda blodkroppar från varje grodyngel analyserades med ett 100×-mikroskop med ett 71-poligt objektiv för att bestämma förekomsten av MN och ENA. Totalt 75 796 röda blodkroppar från grodyngel utvärderades med hänsyn till cypermetrinkoncentrationer och kontroller. Genotoxicitet analyserades enligt metoden av Carrasco et al. och Fenech et al.38,72 genom att bestämma frekvensen av följande kärnskador: (1) anukleära celler: celler utan kärna; (2) apoptotiska celler: kärnfragmentering, programmerad celldöd; (3) binukleära celler: celler med två kärnor; (4) kärnknoppar eller blebceller: celler med kärnor med små utskjutande delar av kärnmembranet, blebceller av liknande storlek som mikrokärnor; (5) karyolyserade celler: celler med endast kärnans konturer utan inre material; (6) skårade celler: celler med kärnor med tydliga sprickor eller skåror i sin form, även kallade njurformade kärnor; (7) lobulerade celler: celler med kärnutbuktningar större än de ovannämnda vesiklarna; och (8) mikroceller: celler med kondenserade kärnor och reducerad cytoplasma. Förändringarna jämfördes med de negativa kontrollresultaten.
Resultaten av akut toxicitetstestet (LC50) analyserades med hjälp av GBasic-programvara och TSK-Trimmed Spearman-Karber-metoden74. Data från det kroniska testet förtestades med avseende på felnormalitet (Shapiro-Wilks) och varianshomogenitet (Bartlett). Resultaten analyserades med hjälp av envägsvariansanalys (ANOVA). Tukeys test användes för att jämföra data sinsemellan och Dunnetts test användes för att jämföra data mellan behandlingsgruppen och den negativa kontrollgruppen.
LOEC- och NOEC-data analyserades med Dunnetts test. Statistiska tester utfördes med hjälp av programvaran Statistica 8.0 (StatSoft) med en signifikansnivå på 95 % (p < 0,05).
Publiceringstid: 13 mars 2025