Denna studie bedömde dödligheten, subletaliteten och toxiciteten hos kommersiella produktercypermetrinformuleringar till anuran grodyngel. I det akuta testet testades koncentrationer på 100–800 μg/L under 96 timmar. I det kroniska testet testades naturligt förekommande cypermetrinkoncentrationer (1, 3, 6 och 20 μg/L) för mortalitet, följt av mikrokärntestning och nukleära avvikelser i röda blodkroppar under 7 dagar. LC50 för den kommersiella cypermetrinformuleringen till grodyngel var 273,41 μg L−1. I det kroniska testet resulterade den högsta koncentrationen (20 μg L−1) i mer än 50 % dödlighet, eftersom den dödade hälften av de testade grodyngeln. Mikronukleustestet visade signifikanta resultat vid 6 och 20 μg L−1 och flera nukleära abnormiteter upptäcktes, vilket tyder på att den kommersiella cypermetrinformuleringen har genotoxisk potential mot P. gracilis. Cypermetrin är en hög risk för denna art, vilket indikerar att det kan orsaka flera problem och påverka dynamiken i detta ekosystem på kort och lång sikt. Därför kan man dra slutsatsen att kommersiella cypermetrinformuleringar har toxiska effekter på P. gracilis.
På grund av den kontinuerliga expansionen av jordbruksverksamhet och intensiv tillämpning avbekämpning av skadedjuråtgärder exponeras vattenlevande djur ofta för bekämpningsmedel1,2. Föroreningar av vattenresurser nära jordbruksfält kan påverka utvecklingen och överlevnaden för icke-målorganismer som groddjur.
Groddjur blir allt viktigare i bedömningen av miljömatriser. Anuraner anses vara goda bioindikatorer för miljöföroreningar på grund av deras unika egenskaper såsom komplexa livscykler, snabba larvtillväxthastigheter, trofisk status, permeabel hud10,11, beroende av vatten för reproduktion12 och oskyddade ägg11,13,14. Den lilla vattengrodan (Physalaemus gracilis), allmänt känd som den gråtande grodan, har visat sig vara en bioindikatorart för bekämpningsmedelsföroreningar4,5,6,7,15. Arten finns i stående vatten, skyddade områden eller områden med varierande livsmiljöer i Argentina, Uruguay, Paraguay och Brasilien1617 och anses stabil enligt IUCN-klassificeringen på grund av dess breda utbredning och tolerans för olika livsmiljöer18.
Subletala effekter har rapporterats hos amfibier efter exponering för cypermetrin, inklusive beteendemässiga, morfologiska och biokemiska förändringar i grodyngel23,24,25, förändrad mortalitet och metamorfostid, enzymatiska förändringar, minskad kläckningsframgång24,25, hyperaktivitet26, hämning av kolinesterasaktivitet, hämning av kolinesterasaktivitet,7. Studier av de genotoxiska effekterna av cypermetrin hos amfibier är dock begränsade. Därför är det viktigt att bedöma känsligheten hos anuranarter för cypermetrin.
Miljöföroreningar påverkar den normala tillväxten och utvecklingen av amfibier, men den allvarligaste negativa effekten är genetiska skador på DNA orsakade av exponering för bekämpningsmedel13. Blodcellsmorfologianalys är en viktig bioindikator på förorening och potentiell toxicitet hos ett ämne för vilda arter29. Mikrokärntestet är en av de mest använda metoderna för att bestämma genotoxiciteten för kemikalier i miljön30. Det är en snabb, effektiv och billig metod som är en bra indikator på kemisk förorening av organismer som groddjur31,32 och kan ge information om exponering för genotoxiska föroreningar33.
Syftet med denna studie var att utvärdera den toxiska potentialen hos kommersiella cypermetrinformuleringar för små vattenlevande grodyngel med hjälp av ett mikrokärntest och ekologisk riskbedömning.
Kumulativ dödlighet (%) av P. gracilis grodyngel exponerade för olika koncentrationer av kommersiellt cypermetrin under den akuta perioden av testet.
Kumulativ dödlighet (%) av P. gracilis grodyngel exponerade för olika koncentrationer av kommersiellt cypermetrin under ett kroniskt test.
Den observerade höga dödligheten var ett resultat av genotoxiska effekter hos amfibier exponerade för olika koncentrationer av cypermetrin (6 och 20 μg/L), vilket framgår av närvaron av mikrokärnor (MN) och nukleära abnormiteter i erytrocyter. Bildning av MN indikerar fel i mitos och är associerad med dålig bindning av kromosomer till mikrotubuli, defekter i proteinkomplex som ansvarar för kromosomupptag och transport, fel i kromosomsegregering och fel i reparation av DNA-skador38,39 och kan vara relaterat till pesticid-inducerad oxidativ stress40,41. Andra abnormiteter observerades vid alla utvärderade koncentrationer. Ökande cypermetrinkoncentrationer ökade nukleära abnormiteter i erytrocyter med 5 % och 20 % vid de lägsta (1 μg/L) respektive högsta (20 μg/L) doserna. Till exempel kan förändringar i en arts DNA ha allvarliga konsekvenser för både kort- och långtidsöverlevnad, vilket resulterar i populationsminskning, förändrad reproduktionsförmåga, inavel, förlust av genetisk mångfald och förändrade migrationshastigheter. Alla dessa faktorer kan påverka arters överlevnad och underhåll42,43. Bildandet av erytroida abnormiteter kan indikera en blockering i cytokinesen, vilket resulterar i onormal celldelning (binukleerade erytrocyter)44,45; flerlobiga kärnor är utsprång av kärnmembranet med flera lober46, medan andra erytroida abnormiteter kan vara associerade med DNA-amplifiering, såsom nukleära njurar/blebs47. Förekomsten av anukleerade erytrocyter kan indikera försämrad syretransport, särskilt i förorenat vatten48,49. Apoptos indikerar celldöd50.
Andra studier har också visat de genotoxiska effekterna av cypermetrin. Kabaña et al.51 visade närvaron av mikrokärnor och kärnförändringar såsom binukleerade celler och apoptotiska celler i Odontophrynus americanus-celler efter exponering för höga koncentrationer av cypermetrin (5 000 och 10 000 μg L−1) under 96 timmar. Cypermetrin-inducerad apoptos upptäcktes också i P. biligonigerus52 och Rhinella arenarum53. Dessa resultat tyder på att cypermetrin har genotoxiska effekter på en rad vattenlevande organismer och att MN- och ENA-analysen kan vara en indikator på subletala effekter på amfibier och kan tillämpas på inhemska arter och vilda populationer som exponeras för giftiga ämnen12.
Kommersiella formuleringar av cypermetrin utgör en hög miljörisk (både akut och kronisk), med HQs som överstiger nivån för US Environmental Protection Agency (EPA)54, vilket kan påverka arten negativt om den finns i miljön. I den kroniska riskbedömningen var NOEC för dödlighet 3 μg L−1, vilket bekräftar att de koncentrationer som finns i vatten kan utgöra en risk för arten55. Den dödliga NOEC för larver av R. arenarum exponerade för en blandning av endosulfan och cypermetrin var 500 μg L−1 efter 168 timmar; detta värde minskade till 0,0005 μg L−1 efter 336 timmar. Författarna visar att ju längre exponering desto lägre koncentrationer som är skadliga för arten. Det är också viktigt att markera att NOEC-värdena var högre än de för P. gracilis vid samma exponeringstid, vilket indikerar att artsvaret på cypermetrin är artspecifikt. Dessutom, i termer av dödlighet, nådde CHQ-värdet för P. gracilis efter exponering för cypermetrin 64,67, vilket är högre än referensvärdet som fastställts av US Environmental Protection Agency54, och CHQ-värdet för R. arenarum-larver var också högre än detta värde (CHQ > 388,00 efter 336 timmar), vilket tyder på att flera arter har en hög risk att studera amphibian. Med tanke på att P. gracilis kräver cirka 30 dagar för att fullborda metamorfos56, kan man dra slutsatsen att de studerade koncentrationerna av cypermetrin kan bidra till befolkningsminskning genom att förhindra infekterade individer från att komma in i vuxen- eller reproduktionsstadiet i tidig ålder.
I den beräknade riskbedömningen av mikrokärnor och andra erytrocytkärnavvikelser varierade CHQ-värdena från 14,92 till 97,00, vilket tyder på att cypermetrin hade en potentiell genotoxisk risk för P. gracilis även i dess naturliga livsmiljö. Med hänsyn till dödligheten var den maximala koncentrationen av främlingsfientliga föreningar som tolereras för P. gracilis 4,24 μg L−1. Koncentrationer så låga som 1 μg/L visade dock också genotoxiska effekter. Detta faktum kan leda till en ökning av antalet onormala individer57 och påverka utvecklingen och reproduktionen av arter i deras livsmiljöer, vilket leder till en minskning av amfibiepopulationerna.
Kommersiella formuleringar av insekticiden cypermetrin visade hög akut och kronisk toxicitet mot P. gracilis. Högre dödlighetsfrekvenser observerades, troligtvis på grund av toxiska effekter, vilket framgår av närvaron av mikrokärnor och erytrocytkärnor, särskilt tandade kärnor, flikiga kärnor och vesikulära kärnor. Dessutom visade de studerade arterna ökade miljörisker, både akuta och kroniska. Dessa data, i kombination med tidigare studier av vår forskargrupp, visade att även olika kommersiella formuleringar av cypermetrin fortfarande orsakade minskad acetylkolinesteras (AChE) och butyrylkolinesteras (BChE) aktiviteter och oxidativ stress58, och resulterade i förändringar i simaktivitet och orala missbildningar59 hos P. gracilis, vilket indikerar att kommersiella subformuleringar av lethalpermethrin har hög halt av lethalpermethrin. Hartmann et al. 60 fann att kommersiella formuleringar av cypermetrin var de mest toxiska för P. gracilis och en annan art av samma släkte (P. cuvieri) jämfört med nio andra bekämpningsmedel. Detta tyder på att lagligt godkända koncentrationer av cypermetrin för miljöskydd kan resultera i hög dödlighet och långvarig befolkningsminskning.
Ytterligare studier behövs för att bedöma bekämpningsmedlets toxicitet för amfibier, eftersom de koncentrationer som finns i miljön kan orsaka hög dödlighet och utgöra en potentiell risk för P. gracilis. Forskning om groddjursarter bör uppmuntras, eftersom data om dessa organismer är knapphändiga, särskilt om brasilianska arter.
Det kroniska toxicitetstestet varade i 168 timmar (7 dagar) under statiska förhållanden och de subletala koncentrationerna var: 1, 3, 6 och 20 μg ai L−1. I båda experimenten utvärderades 10 grodyngel per behandlingsgrupp med sex replikat, för totalt 60 grodyngel per koncentration. Under tiden fungerade behandlingen med endast vatten som en negativ kontroll. Varje experimentuppställning bestod av en steril glasskål med en kapacitet på 500 ml och en densitet på 1 grodyngel per 50 ml lösning. Kolven täcktes med polyetenfilm för att förhindra avdunstning och luftades kontinuerligt.
Vattnet analyserades kemiskt för att bestämma koncentrationer av bekämpningsmedel vid 0, 96 och 168 timmar. Enligt Sabin et al. 68 och Martins et al. 69 utfördes analyserna vid Pesticide Analysis Laboratory (LARP) vid Federal University of Santa Maria med användning av gaskromatografi kopplad till trippelkvadrupolmasspektrometri (Varian modell 1200, Palo Alto, Kalifornien, USA). Den kvantitativa bestämningen av bekämpningsmedel i vatten visas som tilläggsmaterial (tabell SM1).
För mikrokärntestet (MNT) och nukleär abnormitetstest för röda blodkroppar (RNA) analyserades 15 grodyngel från varje behandlingsgrupp. Grodyngel bedövades med 5% lidokain (50 mg g-170) och blodprover togs genom hjärtpunktion med användning av hepariniserade engångssprutor. Blodutstryk preparerades på sterila objektglas, lufttorkades, fixerades med 100 % metanol (4 °C) i 2 minuter och färgades sedan med 10 % Giemsa-lösning i 15 minuter i mörker. Vid slutet av processen tvättades objektglasen med destillerat vatten för att avlägsna överskott av fläck och torkades vid rumstemperatur.
Minst 1000 RBC från varje grodyngel analyserades med ett 100× mikroskop med ett 71 objektiv för att bestämma närvaron av MN och ENA. Totalt 75 796 RBC från grodyngel utvärderades med hänsyn till cypermetrinkoncentrationer och kontroller. Genotoxicitet analyserades enligt metoden enligt Carrasco et al. och Fenech et al.38,72 genom att bestämma frekvensen av följande nukleära lesioner: (1) anukleära celler: celler utan kärnor; (2) apoptotiska celler: kärnfragmentering, programmerad celldöd; (3) binukleära celler: celler med två kärnor; (4) nukleära knoppar eller blåsceller: celler med kärnor med små utsprång av kärnmembranet, blåsor liknande mikrokärnor i storlek; (5) karyolyserade celler: celler med endast konturerna av kärnan utan inre material; (6) skårade celler: celler med kärnor med tydliga sprickor eller skåror i sin form, även kallade njurformade kärnor; (7) lobulerade celler: celler med kärnutsprång större än de tidigare nämnda vesiklerna; och (8) mikroceller: celler med kondenserade kärnor och reducerad cytoplasma. Förändringarna jämfördes med de negativa kontrollresultaten.
Testresultaten för akut toxicitet (LC50) analyserades med GBasic-programvara och TSK-Trimmed Spearman-Karber-metoden74. De kroniska testdata förtestades för felnormalitet (Shapiro-Wilks) och varianshomogenitet (Bartlett). Resultaten analyserades med användning av envägsvariansanalys (ANOVA). Tukeys test användes för att jämföra data sinsemellan, och Dunnetts test användes för att jämföra data mellan behandlingsgruppen och den negativa kontrollgruppen.
LOEC- och NOEC-data analyserades med Dunnetts test. Statistiska tester utfördes med hjälp av programvaran Statistica 8.0 (StatSoft) med en signifikansnivå på 95 % (p < 0,05).
Posttid: Mar-13-2025