Den säsongsbetonade fördelningen av nederbörd i Guizhou-provinsen är ojämn, med mer nederbörd på våren och sommaren, men rapsplantor är känsliga för torkstress under hösten och vintern, vilket allvarligt påverkar avkastningen. Senap är en speciell oljeväxtgröda som huvudsakligen odlas i Guizhou-provinsen. Den har stark torktolerans och kan odlas i bergsområden. Det är en rik resurs av torktåliga gener. Upptäckten av torktåliga gener är av avgörande betydelse för förbättring av senapssorter och innovation inom groddplasmaresurser. GRF-familjen spelar en avgörande roll i växternas tillväxt och utveckling och respons på torkstress. För närvarande har GRF-gener hittats i Arabidopsis 2, ris (Oryza sativa) 12, raps 13, bomull (Gossypium hirsutum) 14, vete (Triticum aestivum) 15, pärlhirs (Setaria italica) 16 och Brassica 17, men det finns inga rapporter om att GRF-gener har upptäckts i senap. I denna studie identifierades GRF-familjens gener hos senap på genomövergripande nivå och deras fysikaliska och kemiska egenskaper, evolutionära släktskap, homologi, konserverade motiv, genstruktur, gendupliker, cis-element och plantstadium (fyrbladsstadium) analyserades. Uttrycksmönstren under torkstress analyserades omfattande för att ge en vetenskaplig grund för vidare studier av BjGRF-geners potentiella funktion i torkrespons och för att tillhandahålla kandidatgener för förädling av torktolerant senap.
Trettiofyra BjGRF-gener identifierades i Brassica juncea-genomet med hjälp av två HMMER-sökningar, vilka alla innehåller QLQ- och WRC-domänerna. CDS-sekvenserna för de identifierade BjGRF-generna presenteras i tilläggstabell S1. BjGRF01–BjGRF34 är namngivna baserat på deras placering på kromosomen. De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos denna familj indikerar att aminosyralängden är mycket variabel och sträcker sig från 261 aminosyrarester (BjGRF19) till 905 aminosyrarester (BjGRF28). Den isoelektriska punkten för BjGRF varierar från 6,19 (BjGRF02) till 9,35 (BjGRF03) med ett genomsnitt på 8,33, och 88,24 % av BjGRF är ett basiskt protein. Det förutspådda molekylviktsintervallet för BjGRF är från 29,82 kDa (BjGRF19) till 102,90 kDa (BjGRF28); Instabilitetsindexet för BjGRF-proteiner varierar från 51,13 (BjGRF08) till 78,24 (BjGRF19), alla är större än 40, vilket indikerar att fettsyraindexet varierar från 43,65 (BjGRF01) till 78,78 (BjGRF22), den genomsnittliga hydrofiliciteten (GRAVY) varierar från -1,07 (BjGRF31) till -0,45 (BjGRF22), alla hydrofila BjGRF-proteiner har negativa GRAVY-värden, vilket kan bero på bristen på hydrofobicitet orsakad av resterna. Subcellulär lokaliseringsprediktion visade att 31 BjGRF-kodade proteiner kunde lokaliseras i kärnan, BjGRF04 kunde lokaliseras i peroxisomer, BjGRF25 kunde lokaliseras i cytoplasman och BjGRF28 kunde lokaliseras i kloroplaster (tabell 1), vilket indikerar att BjGRF kan vara lokaliserade i kärnan och spela en viktig reglerande roll som en transkriptionsfaktor.
Fylogenetisk analys av GRF-familjer i olika arter kan hjälpa till att studera genfunktioner. Därför laddades aminosyrasekvenserna i full längd ner från 35 GRF från raps, 16 från kålrot, 12 från ris, 10 från hirs och 9 från Arabidopsis, och ett fylogenetiskt träd konstruerades baserat på 34 identifierade BjGRF-gener (Fig. 1). De tre underfamiljerna innehåller olika antal medlemmar; 116 GRF-TF är indelade i tre olika underfamiljer (grupperna A~C), innehållande 59 (50,86%), 34 (29,31%) respektive 23 (19,83)% av GRF:erna. Bland dem är 34 medlemmar av BjGRF-familjen spridda över 3 underfamiljer: 13 medlemmar i grupp A (38,24%), 12 medlemmar i grupp B (35,29%) och 9 medlemmar i grupp C (26,47%). I processen med senapspolyploidisering är antalet BjGRF-gener i olika underfamiljer olika, och genamplifiering och förlust kan ha inträffat. Det är värt att notera att det inte finns någon fördelning av ris- och hirs-GRF i grupp C, medan det finns 2 ris-GRF och 1 hirs-GRF i grupp B, och de flesta ris- och hirs-GRF är grupperade i en gren, vilket indikerar att BjGRF är nära besläktade med dikotyledoner. Bland dem ger de mest djupgående studierna av GRF-funktionen i Arabidopsis thaliana en grund för funktionella studier av BjGRF.
Fylogenetiskt träd av senap inklusive Brassica napus, Brassica napus, ris, hirs och medlemmar av Arabidopsis thaliana GRF-familjen.
Analys av repetitiva gener i senaps-GRF-familjen. Den grå linjen i bakgrunden representerar ett synkroniserat block i senapsgenomet, den röda linjen representerar ett par segmenterade upprepningar av BjGRF-genen;
BjGRF-genuttryck under torkstress i fjärde bladstadiet. qRT-PCR-data visas i tilläggstabell S5. Signifikanta skillnader i data indikeras med gemener.
I takt med att det globala klimatet fortsätter att förändras har det blivit ett hett forskningsämne att studera hur grödor hanterar torkstress och förbättrar deras toleransmekanismer18. Efter torka kommer växternas morfologiska struktur, genuttryck och metaboliska processer att förändras, vilket kan leda till att fotosyntesen upphör och metaboliska störningar, vilket påverkar grödornas avkastning och kvalitet19,20,21. När växter känner av torksignaler producerar de andra budbärare som Ca2+ och fosfatidylinositol, ökar den intracellulära kalciumjonkoncentrationen och aktiverar det reglerande nätverket av proteinfosforyleringsvägen22,23. Det slutliga målproteinet är direkt involverat i cellulärt försvar eller reglerar uttrycket av relaterade stressgener genom TF:er, vilket förbättrar växternas tolerans mot stress24,25. Således spelar TF:er en avgörande roll för att reagera på torkstress. Beroende på sekvensen och DNA-bindningsegenskaperna hos torkstressresponsiva TF:er kan TF:er delas in i olika familjer, såsom GRF, ERF, MYB, WRKY och andra familjer26.
GRF-genfamiljen är en typ av växtspecifik TF som spelar viktiga roller i olika aspekter såsom tillväxt, utveckling, signaltransduktion och växters försvarssvar27. Sedan den första GRF-genen identifierades i O. sativa28 har fler och fler GRF-gener identifierats i många arter och visat sig påverka växters tillväxt, utveckling och stressrespons8, 29, 30,31,32. Med publiceringen av Brassica juncea-genomsekvensen blev identifieringen av BjGRF-genfamiljen möjlig33. I denna studie identifierades 34 BjGRF-gener i hela senapsgenomet och namngavs BjGRF01–BjGRF34 baserat på deras kromosomala position. Alla innehåller mycket konserverade QLQ- och WRC-domäner. Analys av de fysikalisk-kemiska egenskaperna visade att skillnaderna i aminosyraantal och molekylvikter hos BjGRF-proteinerna (förutom BjGRF28) inte var signifikanta, vilket indikerar att medlemmarna i BjGRF-familjen kan ha liknande funktioner. Genstrukturanalys visade att 64,7 % av BjGRF-generna innehöll 4 exoner, vilket indikerar att BjGRF-genstrukturen är relativt konserverad under evolutionen, men antalet exoner i BjGRF10-, BjGRF16-, BjGRP28- och BjGRF29-generna är större. Studier har visat att tillägg eller borttagning av exoner eller introner kan leda till skillnader i genstruktur och funktion, vilket därigenom skapar nya gener34,35,36. Därför spekulerar vi i att intronen i BjGRF förlorades under evolutionen, vilket kan orsaka förändringar i genfunktionen. I överensstämmelse med befintliga studier fann vi också att antalet introner var associerat med genuttryck. När antalet introner i en gen är stort kan genen snabbt reagera på olika ogynnsamma faktorer.
Genduplikation är en viktig faktor i genomisk och genetisk evolution37. Relaterade studier har visat att genduplikation inte bara ökar antalet GRF-gener, utan också fungerar som ett sätt att generera nya gener som hjälper växter att anpassa sig till olika ogynnsamma miljöförhållanden38. Totalt 48 duplicerade genpar hittades i denna studie, alla segmentala duplikationer, vilket indikerar att segmentala duplikationer är den viktigaste mekanismen för att öka antalet gener i denna familj. Det har rapporterats i litteraturen att segmental duplikation effektivt kan främja amplifieringen av GRF-genfamiljemedlemmar i Arabidopsis och jordgubb, och ingen tandemduplikation av denna genfamilj hittades i någon av arterna27,39. Resultaten av denna studie överensstämmer med befintliga studier av Arabidopsis thaliana och jordgubbsfamiljer, vilket tyder på att GRF-familjen kan öka antalet gener och generera nya gener genom segmental duplikation i olika växter.
I denna studie identifierades totalt 34 BjGRF-gener i senap, vilka delades in i tre underfamiljer. Dessa gener uppvisade liknande konserverade motiv och genstrukturer. Kollinearitetsanalys avslöjade 48 par av segmentduplikationer i senap. BjGRF-promotorregionen innehåller cis-verkande element associerade med ljusrespons, hormonrespons, miljöstressrespons samt tillväxt och utveckling. Uttrycket av 34 BjGRF-gener detekterades i senapsplantstadiet (rötter, stjälkar, blad), och uttrycksmönstret för 10 BjGRF-gener detekterades under torkaförhållanden. Det visade sig att uttrycksmönstren för BjGRF-gener under torkstress var likartade och kan vara likartade. BjGRF03- och BjGRF32-gener kan spela positiva reglerande roller vid torkstress, medan BjGRF06 och BjGRF23 spelar roller vid torkstress som miR396-målgener. Sammantaget ger vår studie en biologisk grund för framtida upptäckter av BjGRF-genfunktionen i Brassicaceae-växter.
Senapsfrön som användes i detta experiment tillhandahölls av Guizhou Oil Seed Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences. Välj ut hela fröna och plantera dem i jord (substrat: jord = 3:1), och samla in rötter, stjälkar och blad efter fyrbladsstadiet. Plantorna behandlades med 20 % PEG 6000 för att simulera torka, och bladen samlades in efter 0, 3, 6, 12 och 24 timmar. Alla växtprover frystes omedelbart i flytande kväve och förvarades sedan i en -80 °C frys för nästa test.
All data som erhållits eller analyserats under denna studie ingår i den publicerade artikeln och kompletterande informationsfiler.
Publiceringstid: 22 januari 2025