Växt- och patogenmaterial
En population för kartläggning av sorghumassociationer, känd som sorghumkonverteringspopulationen (SCP), tillhandahölls av Dr. Pat Brown vid University of Illinois (nu vid UC Davis). Den har beskrivits tidigare och är en samling av olika linjer som konverterats till fotoperiodokänslighet och mindre storlek för att underlätta växternas tillväxt och utveckling i amerikanska miljöer. 510 linjer från denna population användes i denna studie, men på grund av dålig groning och andra kvalitetskontrollproblem användes inte alla linjer i analysen av alla tre egenskaper. Slutligen användes data från 345 linjer för analysen av kitinresponsen, 472 linjer för flg22-responsen och 456 för TLS-resistens.B. cookeiStammen LSLP18 erhölls från Dr. Burt Bluhm vid University of Arkansas.
MAMP-svarsmätning
Två olika MAMP:er användes i denna studie, flg22 (Genscript katalognummer RP19986) och kitin. Sorghumplantor odlades i insatser placerade på ytor fyllda med jord (33 % Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) i växthuset. Plantorna vattnades dagen före provinsamling för att undvika extra bladfukt på insamlingsdagen.
Linjerna randomiserades och planterades av logistiska skäl i omgångar om 60 linjer. För varje linje planterades tre "krukor" med två frön per linje. Efterföljande omgångar planterades så snart den föregående omgången hade bearbetats tills hela populationen hade utvärderats. Två experimentella omgångar genomfördes för båda MAMP:erna med genotyper omrandomiserade i var och en av de två omgångarna.
ROS-analyser utfördes enligt tidigare beskrivning. Kortfattat planterades sex frön i tre olika krukor för varje linje. Från de resulterande plantorna valdes tre ut baserat på enhetlighet. Plantor som såg ovanliga ut eller var betydligt högre eller kortare än majoriteten användes inte. Fyra bladskivor med 3 mm diameter skars ut från den bredaste delen av det fjärde bladet på tre olika 15 dagar gamla sorghumplantor. En skiva per blad från två plantor och två skivor från en planta, där den andra skivan blev vattenkontroll (se nedan). Skivorna flöt individuellt på 50 µl H2O i en svart 96-brunnsplatta, förseglades med en aluminiumtätning för att undvika exponering för ljus och förvarades vid rumstemperatur över natten. Nästa morgon framställdes en reaktionslösning med 2 mg/ml kemiluminescerande prob L-012 (Wako, katalognummer 120-04891), 2 mg/ml pepparrotsperoxidas (typ VI-A, Sigma-Aldrich, katalognummer P6782) och 100 mg/ml kitin eller 2 μM Flg22. 50 µl av denna reaktionslösning tillsattes till tre av de fyra brunnarna. Den fjärde brunnen var en simulerad kontroll, till vilken reaktionslösningen exklusive MAMP tillsattes. Fyra tomma brunnar innehållande endast vatten inkluderades också i varje platta.
Efter tillsats av reaktionslösningen mättes luminescensen med hjälp av SynergyTM 2 multidetektionsmikroplattläsare (BioTek) varannan minut i 1 timme. Plattläsaren gör luminescensmätningar varannan minut under denna timme. Summan av alla 31 avläsningar beräknades för att ge värdet för varje brunn. Det uppskattade värdet för MAMP-svaret för varje genotyp beräknades som (genomsnittligt luminescensvärde för de tre experimentbrunnarna - övningsbrunnsvärdet) - minus det genomsnittliga värdet för blindbrunnen. Värdena för blindbrunnarna var genomgående nära noll.
Bladskivor avNicotiana benthamiana, en sorghumlinje med hög respons (SC0003) och en sorghumlinje med låg respons (PI 6069) inkluderades också som kontroller i varje 96-brunnsplatta för kvalitetskontrollsändamål.
B. cookeiinokulumberedning och inokulering
B. cookeiInokulum framställdes enligt tidigare beskrivning. Kortfattat blötlades sorghummjöl i vatten i tre dagar, sköljdes, hälldes i 1-liters koniska kolvar och autoklaverades i en timme vid 15 psi och 121 °C. Mjölkkornen inokulerades sedan med cirka 5 ml macererat mycel från en färsk kultur avB. cookeiLSLP18-isolaten togs och lämnades i 2 veckor i rumstemperatur, medan kolvarna skakades var tredje dag. Efter 2 veckor lufttorkades de svampangripna sorghumkornen och förvarades sedan vid 4 °C fram till fältinokulering. Samma inokulum användes under hela försöket och gjordes färskt varje år. För inokulering placerades 6–10 angripna korn i en virvel av 4–5 veckor gamla sorghumplantor. Sporerna som producerades från dessa svampar initierade infektion i de unga sorghumplantorna inom en vecka.
Fröberedning
Före plantering på fältet behandlades sorghumfrön med en blandning av fungicid, insekticid och skyddsmedel innehållande ~ 1 % Spirato 480 FS fungicid, 4 % Sebring 480 FS fungicid och 3 % Sorpro 940 ES fröskyddsmedel. Därefter lufttorkades fröna i 3 dagar, vilket gav ett tunt lager av denna blandning runt fröna. Skyddsmedlet möjliggjorde användning av herbiciden Dual Magnum som behandling före uppkomst.
Utvärdering av resistens mot målbladfläckar
SCP planterades vid Central Crops Research Station i Clayton, North Carolina, den 14–15 juni 2017 och den 20 juni 2018 i en randomiserad komplett blockdesign med två experimentella replikationer i varje fall. Experimenten planterades i 1,8 m breda enkla rader med en radbredd på 0,9 m med 10 frön per parsell. Två kantrader planterades runt periferin av varje experiment för att förhindra kanteffekter. Experimenten inokulerades den 20 juli 2017 och 20 juli 2018, då sorghumplantorna var i tillväxtstadium 3. Betygen gjordes på en skala från ett till nio, där plantor som inte visade några tecken på sjukdom poängsattes som en nia och helt döda plantor poängsattes som ett. Två betyg gjordes under 2017 och fyra avläsningar under 2018 med början två veckor efter inokulering varje år. sAUDPC (standardiserad area under sjukdomsprogressionskurvan) beräknades enligt tidigare beskrivning.
Publiceringstid: 1 april 2021