Tallnematoden är en migrerande endoparasit i karantän som är känd för att orsaka allvarliga ekonomiska förluster i tallskogarnas ekosystem. Den aktuella studien granskar den nematicida aktiviteten hos halogenerade indoler mot tallnematoder och deras verkningsmekanism. De nematicida aktiviteterna av 5-jodoindol och avermektin (positiv kontroll) mot tallnematoder var likartade och höga vid låga koncentrationer (10 μg/mL). 5-jodoindol minskade fruktsamhet, reproduktionsaktivitet, embryonal och larverdödlighet och rörelsebeteende. Molekylära interaktioner av ligander med ryggradslösa specifika glutamat-styrda kloridkanalreceptorer stödjer uppfattningen att 5-jodoindol, liksom avermektin, binder tätt till det receptoraktiva stället. 5-jodoindol inducerade också olika fenotypiska deformationer i nematoder, inklusive onormal organkollaps/krympning och ökad vakuolisering. Dessa resultat tyder på att vakuoler kan spela en roll i nematodmetyleringsmedierad död. Viktigt är att 5-jodoindol var ogiftigt för båda växtarterna (kål och rädisa). Således visar denna studie att applicering av jodoindol under miljöförhållanden kan kontrollera tallvissningsskada.
Tallvedsnematod (Bursaphelenchus xylophilus) tillhör tallvedsnematoder (PWN), migrerande endoparasitiska nematoder som är kända för att orsaka allvarliga ekologiska skador på tallskogarnas ekosystem1. Tall vissnesjuka (PWD) orsakad av tallvedsnematoden håller på att bli ett allvarligt problem på flera kontinenter, inklusive Asien och Europa, och i Nordamerika förstör nematoden introducerade tallarter1,2. Nedgången av tallar är ett stort ekonomiskt problem, och utsikterna för dess globala spridning är oroande3. Följande tallarter angrips oftast av nematoden: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii och Pinus radiata4. Tallnematod är en allvarlig sjukdom som kan döda tallar inom veckor eller månader efter infektion. Dessutom är utbrott av tallnematoder vanliga i en mängd olika ekosystem, så ihållande infektionskedjor har etablerats1.
Bursaphelenchus xylophilus är en karantänväxtparasitisk nematod som tillhör överfamiljen Aphelenchoidea och clade 102.5. Nematoden livnär sig på svampar och förökar sig i tallars trävävnader och utvecklas till fyra olika larvstadier: L1, L2, L3, L4 och en vuxen individ1,6. Under förhållanden med matbrist övergår tallnematoden till ett specialiserat larvstadium – dauer, som parasiterar sin vektor – tallbarkborren (Monochamus alternatus) och överförs till friska tallar. Hos friska värdar vandrar nematoder snabbt genom växtvävnader och livnär sig på parenkymatösa celler, vilket leder till ett antal överkänslighetsreaktioner, tallvissning och död inom ett år efter infektion1,7,8.
Biologisk bekämpning av tallnematoder har länge varit en utmaning, med karantänåtgärder som går tillbaka till 1900-talet. Nuvarande strategier för att bekämpa tallnematoder involverar främst kemiska behandlingar, inklusive rökgasning och implantation av nematicider i trädstammar. De vanligaste nematiciderna är avermektin och avermektinbensoat, som tillhör avermektinfamiljen. Dessa dyra kemikalier är mycket effektiva mot många nematodarter och anses vara miljösäkra9. Upprepad användning av dessa nematicider förväntas dock skapa selektionstryck som med största sannolikhet kommer att leda till uppkomsten av resistenta tallnematoder, vilket har påvisats för flera skadeinsekter, såsom Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella och nematoderna Trichostrongylus colubriformis och Ostertagia circum, som har utvecklat resistens mot graducinacta circ. avermektiner 10,11,12. Därför behöver resistensmönster regelbundet studeras och nematicider screenas kontinuerligt för att hitta alternativa, kostnadseffektiva och miljövänliga åtgärder för att kontrollera PVD. Under de senaste decennierna har ett antal författare föreslagit användning av växtextrakt, eteriska oljor och flyktiga ämnen som medel för att bekämpa nematod13,14,15,16.
Vi demonstrerade nyligen den nematicida aktiviteten hos indol, en intercellulär och interkingdom-signalmolekyl, i Caenorhabditis elegans 17 . Indol är en utbredd intracellulär signal inom mikrobiell ekologi, som styr många funktioner som påverkar mikrobiell fysiologi, sporbildning, plasmidstabilitet, läkemedelsresistens, biofilmbildning och virulens 18, 19 . Aktiviteten av indol och dess derivat mot andra patogena nematoder har inte studerats. I denna studie undersökte vi den nematicida aktiviteten hos 34 indoler mot tallnematoder och belyst verkningsmekanismen för den mest potenta 5-jodoindolen med hjälp av mikroskopi, time-lapse-fotografering och molekylära dockningsexperiment, och bedömde dess toxiska effekter på växter med hjälp av en frögroningsanalys.
Höga koncentrationer (>1,0 mM) av indol har tidigare rapporterats ha en nematicid effekt på nematoder17. Efter behandling av B. xylophilus (blandade livsstadier) med indol eller 33 olika indolderivat vid 1 mM, mättes dödligheten för B. xylophilus genom att räkna levande och döda nematoder i kontroll- och behandlade grupper. Fem indoler uppvisade signifikant nematicid aktivitet; överlevnaden för den obehandlade kontrollgruppen var 95 ± 7 % efter 24 timmar. Av de 34 testade indolerna orsakade 5-jodoindol och 4-fluoroindol vid 1 mM 100 % dödlighet, medan 5,6-difluorindigo, metylindol-7-karboxylat och 7-jodoindol orsakade cirka 50 % dödlighet (tabell 1).
Effekt av 5-jodoindol på vakuolbildning och metabolism av tallvedsnematod. (A) Effekt av avermektin och 5-jodoindol på vuxna hannematoder, (B) nematodägg i L1-stadiet och (C) metabolism av B. xylophilus, (i) vakuoler observerades inte vid 0 h, behandling resulterade i (ii) vakuoler, (iii) ackumulering av flera vakuoler, (iv) fusion av vacuoler, (iv) fusion av vacuoler vakuoler och (vi) bildning av jättevakuoler. Röda pilar indikerar svullnad av vakuoler, blå pilar indikerar fusion av vakuoler och svarta pilar indikerar jättevakuoler. Skalstång = 50 μm.
Dessutom beskrev denna studie också den sekventiella processen av metaninducerad död i tallnematoder (Figur 4C). Metanogen död är en icke-apoptotisk typ av celldöd associerad med ackumulering av framträdande cytoplasmatiska vakuoler27. De morfologiska defekterna som observerats i tallnematoder verkar vara nära besläktade med mekanismen för metaninducerad död. Mikroskopisk undersökning vid olika tidpunkter visade att jättevakuoler bildades efter 20 timmars exponering för 5-jodoindol (0,1 mM). Mikroskopiska vakuoler observerades efter 8 timmars behandling och deras antal ökade efter 12 timmar. Flera stora vakuoler observerades efter 14 timmar. Flera sammansmälta vakuoler var tydligt synliga efter 12–16 timmars behandling, vilket indikerar att vakuolfusion är grunden för den metanogene dödsmekanismen. Efter 20 timmar hittades flera gigantiska vakuoler i hela masken. Dessa observationer representerar den första rapporten om metuos hos C. elegans.
Hos 5-jodoindolbehandlade maskar observerades också vakuolaggregation och bristning (fig. 5), vilket framgår av maskböjning och vakuolutsläpp i miljön. Vakuolavbrott observerades också i äggskalsmembranet, som normalt bevaras intakt av L2 under kläckningen (tilläggsbild S2). Dessa observationer stödjer involveringen av vätskeansamling och osmoregulatoriskt misslyckande, såväl som reversibel cellskada (RCI), i processen med vakuolbildning och suppuration (Fig. 5).
Med en hypotes om jods roll i den observerade vakuolbildningen undersökte vi den nematicida aktiviteten av natriumjodid (NaI) och kaliumjodid (KI). Men vid koncentrationer (0,1, 0,5 eller 1 mM) påverkade de varken nematodöverlevnad eller vakuolbildning (kompletterande Fig. S5), även om 1 mM KI hade en lätt nematicid effekt. Å andra sidan inducerade 7-jodoindol (1 eller 2 mM), som 5-jodoindol, flera vakuoler och strukturella deformationer (kompletterande fig. S6). De två jodoindolerna visade liknande fenotypiska egenskaper i tallnematoder, medan NaI och KI inte gjorde det. Intressant nog inducerade inte indol vakuolbildning i B. xylophilus vid de testade koncentrationerna (data visas ej). Resultaten bekräftade således att indol-jodkomplexet är ansvarigt för vakuoliseringen och metabolismen av B. xylophilus.
Bland de indoler som testades för nematicid aktivitet hade 5-jodoindol det högsta glidindexet på -5,89 kcal/mol, följt av 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindol (-4,33) och indol (-4,03) (Figur 6). Den starka vätebindningen av 5-jodoindol till leucin 218 stabiliserar dess bindning, medan alla andra indolderivat binder till serin 260 via sidokedjevätebindningar. Bland andra modellerade jodoindoler har 2-jodoindol ett bindningsvärde på -5,248 kcal/mol, vilket beror på dess huvudsakliga vätebindning med leucin 218. Andra kända bindningar inkluderar 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,0 kcal/mol.) och 6-2 kcal/mol. Figur S8). De flesta halogenerade indoler och indol i sig, med undantag för 5-jodoindol och 2-jodoindol, bildar en bindning med serin 260. Det faktum att vätebindning med leucin 218 indikerar effektiv receptor-ligandbindning, som observerats för ivermektin (tilläggsbild S7), bekräftar att 5-iodoindol-liknande och iodoindol- och leucin-218-bindning. ivermektin, binder tätt till det aktiva stället för GluCL-receptorn via leucin 218 (fig. 6 och kompletterande fig. S8). Vi föreslår att denna bindning krävs för att upprätthålla den öppna porstrukturen i GluCL-komplexet och att genom att tätt binda till det aktiva stället för GluCL-receptorn, 5-jodoindol, 2-jodoindol, avermektin och ivermektin, så håller jonkanalen öppen och tillåter vätskeupptag.
Molekylär dockning av indol och halogenerad indol till GluCL. Bindningsorientering av (A) indol, (B) 4-fluorindol, (C) 7-jodoindol och (D) 5-jodoindol ligander till det aktiva stället för GluCL. Proteinet representeras av ett band och vätebindningarna i ryggraden visas som gula streckade linjer. (A′), (B′), (C′) och (D′) visar interaktionerna av motsvarande ligander med de omgivande aminosyraresterna, och sidokedjevätebindningarna indikeras med rosa prickade pilar.
Experiment utfördes för att utvärdera den toxiska effekten av 5-jodoindol på groningen av kål- och rädisafrön. 5-jodoindol (0,05 eller 0,1 mM) eller avermektin (10 μg/ml) hade liten eller ingen effekt på initial groning och uppkomst av plantor (Figur 7). Dessutom hittades ingen signifikant skillnad mellan grobarheten för obehandlade kontroller och frön behandlade med 5-jodoindol eller avermektin. Effekten på pålrotsförlängning och antalet bildade sidorötter var obetydlig, även om 1 mM (10 gånger dess aktiva koncentration) av 5-jodoindol försenade utvecklingen av sidorötter något. Dessa resultat indikerar att 5-jodoindol är ogiftigt för växtceller och inte stör växtutvecklingsprocesser vid de studerade koncentrationerna.
Effekt av 5-jodoindol på frögroning. Groning, groning och lateral rotning av B. oleracea och R. raphanistrum frön på Murashige och Skoog agar medium med eller utan avermektin eller 5-jodoindol. Groningen registrerades efter 3 dagars inkubation vid 22°C.
Denna studie rapporterar flera fall av nematoddödande av indoler. Viktigt är att detta är den första rapporten om jodoindol-inducerande metylering (en process som orsakas av ackumulering av små vakuoler som gradvis smälter samman i gigantiska vakuoler, vilket så småningom leder till membranruptur och död) i tallbarr, med jodoindol som uppvisar betydande nematicida egenskaper som liknar de hos den kommersiella nemainiciden.
Indoler har tidigare rapporterats utöva flera signalfunktioner i prokaryoter och eukaryoter, inklusive biofilmshämning/bildning, bakteriell överlevnad och patogenicitet19,32,33,34. Nyligen har de potentiella terapeutiska effekterna av halogenerade indoler, indolalkaloider och semisyntetiska indolderivat väckt omfattande forskningsintresse35,36,37. Till exempel har halogenerade indoler visats döda ihållande celler från Escherichia coli och Staphylococcus aureus37. Dessutom är det av vetenskapligt intresse att studera effekten av halogenerade indoler mot andra arter, släkten och riken, och denna studie är ett steg mot att uppnå detta mål.
Här föreslår vi en mekanism för 5-jodoindol-inducerad dödlighet i C. elegans baserat på reversibel cellskada (RCI) och metylering (figur 4C och 5). Ödematösa förändringar som svullnader och vakuolär degeneration är indikatorer på RCI och metylering, manifesterad som jättevakuoler i cytoplasman48,49. RCI stör energiproduktionen genom att minska ATP-produktionen, orsaka fel på ATPase-pumpen eller störa cellmembranen och orsaka ett snabbt inflöde av Na+, Ca2+ och vatten50,51,52. Intracytoplasmatiska vakuoler uppstår i djurceller som ett resultat av vätskeansamling i cytoplasman på grund av inflödet av Ca2+ och vatten53. Intressant nog är denna mekanism för cellskador reversibel om skadan är tillfällig och cellerna börjar producera ATP under en viss tid, men om skadan kvarstår eller förvärras dör cellerna.54 Våra observationer visar att nematoder som behandlats med 5-jodoindol inte kan återställa normal biosyntes efter exponering för stresstillstånd.
Metyleringsfenotypen inducerad av 5-jodoindol i B. xylophilus kan bero på närvaron av jod och dess molekylära fördelning, eftersom 7-jodoindol hade mindre hämmande effekt på B. xylophilus än 5-jodoindol (tabell 1 och kompletterande figur S6). Dessa resultat överensstämmer delvis med studierna av Maltese et al. (2014), som rapporterade att translokation av pyridylkvävedelen i indol från para- till metapositionen avskaffade vakuolisering, tillväxthämning och cytotoxicitet i U251-celler, vilket tyder på att interaktionen av molekylen med ett specifikt aktivt ställe i proteinet är kritisk27,44,45. Interaktionerna mellan indol eller halogenerade indoler och GluCL-receptorer som observerades i denna studie stöder också denna uppfattning, eftersom 5- och 2-jodoindol befanns binda till GluCL-receptorer starkare än de andra undersökta indolerna (Figur 6 och kompletterande figur S8). Joden vid den andra eller femte positionen av indolen befanns binda till leucin 218 i GluCL-receptorn via vätebindningar i ryggraden, medan andra halogenerade indoler och indol i sig bildar svaga sidokedjevätebindningar med serin 260 (Figur 6). Vi spekulerar därför att lokaliseringen av halogenen spelar en viktig roll i induktionen av vakuolär degeneration, medan den täta bindningen av 5-jodoindol håller jonkanalen öppen, vilket möjliggör snabbt vätskeinflöde och vakuolbrott. Den detaljerade verkningsmekanismen för 5-jodoindol återstår dock att fastställa.
Innan praktisk tillämpning av 5-jodoindol bör dess toxiska effekt på växter analyseras. Våra frögroningsexperiment visade att 5-jodoindol inte hade någon negativ effekt på frögroning eller efterföljande utvecklingsprocesser vid de studerade koncentrationerna (Figur 7). Således ger denna studie en grund för användningen av 5-jodoindol i den ekologiska miljön för att kontrollera tallnematodernas skadlighet för tallar.
Tidigare rapporter har visat att indolbaserad behandling representerar en potentiell metod för att hantera problemet med antibiotikaresistens och cancerprogression55. Dessutom har indoler antibakteriella, anticancerösa, antioxidanta, antiinflammatoriska, antidiabetiska, antivirala, antiproliferativa och antituberkulosegenskaper och kan tjäna som en lovande grund för läkemedelsutveckling56,57. Denna studie antyder för första gången potentiell användning av jod som ett antiparasitiskt och avmaskningsmedel.
Avermectin upptäcktes för tre decennier sedan och vann Nobelpriset 2015, och dess användning som ett anthelmintikum pågår fortfarande aktivt. Men på grund av den snabba utvecklingen av resistens mot avermektiner i nematoder och skadeinsekter behövs en alternativ, billig och miljövänlig strategi för att kontrollera PWN-infektion i tallar. Denna studie rapporterar också mekanismen genom vilken 5-jodoindol dödar tallnematoder och att 5-jodoindol har låg toxicitet för växtceller, vilket öppnar upp för goda möjligheter för dess framtida kommersiella tillämpning.
Alla experiment godkändes av den etiska kommittén vid Yeungnam University, Gyeongsan, Korea, och metoderna utfördes i enlighet med riktlinjerna från Yeungnam Universitys etiska kommitté.
Ägginkubationsexperiment utfördes med hjälp av etablerade procedurer43. För att bedöma kläckningshastigheter (HR), överfördes 1 dag gamla vuxna nematoder (ungefär 100 honor och 100 hanar) till petriskålar innehållande svampen och fick växa i 24 timmar. Ägg isolerades sedan och behandlades med 5-jodoindol (0,05 mM och 0,1 mM) eller avermektin (10 μg/ml) som en suspension i sterilt destillerat vatten. Dessa suspensioner (500 μl; cirka 100 ägg) överfördes till brunnarna på en vävnadsodlingsplatta med 24 brunnar och inkuberades vid 22 °C. L2-räkningar gjordes efter 24 timmars inkubation men ansågs vara döda om cellerna inte rörde sig när de stimulerades med en fin platinatråd. Detta experiment genomfördes i två steg, vardera med sex repetitioner. Data från båda experimenten kombinerades och presenterades. Procentandelen av HR beräknas enligt följande:
Larvdödligheten utvärderades med hjälp av tidigare utvecklade procedurer. Nematodägg samlades in och embryon synkroniserades genom kläckning i sterilt destillerat vatten för att generera larver i L2-stadiet. Synkroniserade larver (cirka 500 nematoder) behandlades med 5-jodoindol (0,05 mM och 0,1 mM) eller avermektin (10 μg/ml) och odlades på B. cinerea Petri-plattor. Efter 48 timmars inkubation vid 22 °C samlades nematoder upp i sterilt destillerat vatten och undersöktes med avseende på närvaron av L2-, L3- och L4-stadier. Närvaron av L3- och L4-stadier indikerade larvtransformation, medan närvaron av L2-stadiet indikerade ingen transformation. Bilder togs med hjälp av iRiS™ Digital Cell Imaging System. Detta experiment genomfördes i två steg, vardera med sex repetitioner. Data från båda experimenten kombinerades och presenterades.
Toxiciteten hos 5-jodoindol och avermektin för frön utvärderades med hjälp av grobarhetstester på Murashige och Skoog agarplattor.62 B. oleracea och R. raphanistrum frön blötlades först i sterilt destillerat vatten under en dag, tvättades med 1 ml 100 % etanol för kommersiellt bruk, steriliserat med 50 % 1 ml blekmedel (50 % 1 ml). 15 min, och tvättas fem gånger med 1 ml sterilt vatten. De steriliserade fröna pressades sedan på groningsagarplattor innehållande 0,86 g/l (0,2X) Murashige- och Skoog-medium och 0,7 % bakteriologisk agar med eller utan 5-jodoindol eller avermektin. Plattorna inkuberades sedan vid 22 °C och bilder togs efter 3 dagars inkubation. Detta experiment genomfördes i två steg, som var och en hade sex repetitioner.
Posttid: 26-2-2025