Tallnematoden är en karantänmigrerande endoparasit känd för att orsaka allvarliga ekonomiska förluster i tallskogsekosystem. Denna studie granskar den nematicida aktiviteten hos halogenerade indoler mot tallnematoder och deras verkningsmekanism. Den nematicida aktiviteten hos 5-jodoindol och avermektin (positiv kontroll) mot tallnematoder var likartad och hög vid låga koncentrationer (10 μg/ml). 5-jodindol minskade fekunditet, reproduktionsaktivitet, embryonal och larvdödlighet samt rörelsebeteende. Molekylära interaktioner mellan ligander och ryggradslösa specifika glutamatstyrda kloridkanalreceptorer stöder uppfattningen att 5-jodindol, liksom avermektin, binder tätt till receptorns aktiva plats. 5-jodindol inducerade också olika fenotypiska deformationer i nematoder, inklusive onormal organkollaps/krympning och ökad vakuolisering. Dessa resultat tyder på att vakuoler kan spela en roll i nematodmetyleringsmedierad död. Viktigt är att 5-jodoindol var giftfri för båda växtarterna (kål och rädisa). Denna studie visar således att applicering av jodoindol under miljöförhållanden kan kontrollera vissnesjuka hos tall.
Tallvedsnematoden (Bursaphelenchus xylophilus) tillhör tallvedsnematoderna (PWN), migrerande endoparasitiska nematoder som är kända för att orsaka allvarliga ekologiska skador på tallskogsekosystem1. Tallvissnesjuka (PWD) orsakad av tallvedsnematoden håller på att bli ett allvarligt problem på flera kontinenter, inklusive Asien och Europa, och i Nordamerika förstör nematoden introducerade tallarter1,2. Minskning av tallträd är ett stort ekonomiskt problem, och utsikterna för dess globala spridning är oroande3. Följande tallarter angrips oftast av nematoden: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii och Pinus radiata4. Tallnematoden är en allvarlig sjukdom som kan döda tallar inom veckor eller månader efter infektion. Dessutom är utbrott av tallnematoder vanliga i en mängd olika ekosystem, så ihållande infektionskedjor har etablerats1.
Bursaphelenchus xylophilus är en karantänväxtparasitisk nematod som tillhör superfamiljen Aphelenchoidea och kladen 102.5. Nematoden livnär sig på svampar och förökar sig i tallars vedvävnader och utvecklas till fyra olika larvstadier: L1, L2, L3, L4 och en vuxen individ1,6. Vid födobrist övergår tallnematoden till ett specialiserat larvstadium – dauer, som parasiterar sin vektor – tallbarkborren (Monochamus alternatus) och överförs till friska tallar. Hos friska värdträd migrerar nematoder snabbt genom växtvävnader och livnär sig på parenkymceller, vilket leder till ett antal överkänslighetsreaktioner, vissnande tall och död inom ett år efter infektion1,7,8.
Biologisk bekämpning av tallnematoder har länge varit en utmaning, med karantänåtgärder som går tillbaka till 1900-talet. Nuvarande strategier för att bekämpa tallnematoder involverar främst kemiska behandlingar, inklusive trägasning och implantation av nematodmedel i trädstammar. De vanligaste nematiciderna är avermektin och avermektinbensoat, som tillhör avermektinfamiljen. Dessa dyra kemikalier är mycket effektiva mot många nematodarter och anses vara miljövänliga9. Upprepad användning av dessa nematodmedel förväntas dock skapa ett urvalstryck som nästan säkert kommer att leda till uppkomsten av resistenta tallnematoder, vilket har visats för flera skadeinsekter, såsom Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella och nematoderna Trichostrongylus colubriformis och Ostertagia circumcincta, som gradvis har utvecklat resistens mot avermektiner10,11,12. Därför behöver resistensmönster studeras regelbundet och nematodbekämpningsmedel screenas kontinuerligt för att hitta alternativa, kostnadseffektiva och miljövänliga åtgärder för att kontrollera PVD. Under de senaste decennierna har ett antal författare föreslagit användning av växtextrakt, eteriska oljor och flyktiga ämnen som nematodbekämpningsmedel13,14,15,16.
Vi demonstrerade nyligen den nematicida aktiviteten hos indol, en intercellulär och interkungarikessignalmolekyl, i Caenorhabditis elegans 17. Indol är en utbredd intracellulär signal i mikrobiell ekologi som kontrollerar ett flertal funktioner som påverkar mikrobiell fysiologi, sporbildning, plasmidstabilitet, läkemedelsresistens, biofilmbildning och virulens 18, 19. Aktiviteten hos indol och dess derivat mot andra patogena nematoder har inte studerats. I denna studie undersökte vi den nematicida aktiviteten hos 34 indoler mot tallnematoder och klargjorde verkningsmekanismen för den mest potenta 5-jodindolen med hjälp av mikroskopi, timelapse-fotografering och molekylära dockningsexperiment, och bedömde dess toxiska effekter på växter med hjälp av en frögroningsanalys.
Höga koncentrationer (>1,0 mM) av indol har tidigare rapporterats ha en nematicidal effekt på nematoder17. Efter behandling av B. xylophilus (blandade livsstadier) med indol eller 33 olika indolderivat vid 1 mM, mättes mortalitet hos B. xylophilus genom att räkna levande och döda nematoder i kontroll- och behandlade grupper. Fem indoler uppvisade signifikant nematicidal aktivitet; överlevnaden för den obehandlade kontrollgruppen var 95 ± 7 % efter 24 timmar. Av de 34 testade indolerna orsakade 5-jodoindol och 4-fluorindol vid 1 mM 100 % mortalitet, medan 5,6-difluorindigo, metylindol-7-karboxylat och 7-jodoindol orsakade cirka 50 % mortalitet (tabell 1).
Effekt av 5-jodoindol på vakuolbildning och metabolism hos tallvedsnematoder. (A) Effekt av avermektin och 5-jodoindol på vuxna hannematoder, (B) nematodägg i L1-stadiet och (C) metabolism av B. xylophilus, (i) inga vakuoler observerades vid 0 timmar, behandling resulterade i (ii) vakuoler, (iii) ansamling av flera vakuoler, (iv) svullnad av vakuoler, (v) fusion av vakuoler och (vi) bildning av jättevakuoler. Röda pilar indikerar svullnad av vakuoler, blå pilar indikerar fusion av vakuoler och svarta pilar indikerar jättevakuoler. Skalstreck = 50 μm.
Dessutom beskrev denna studie även den sekventiella processen för metaninducerad död i tallnematoder (Figur 4C). Metanogen död är en icke-apoptotisk typ av celldöd som är associerad med ackumulering av framträdande cytoplasmatiska vakuoler27. De morfologiska defekter som observerats i tallnematoder verkar vara nära relaterade till mekanismen för metaninducerad död. Mikroskopisk undersökning vid olika tidpunkter visade att jättevakuoler bildades efter 20 timmars exponering för 5-jodoindol (0,1 mM). Mikroskopiska vakuoler observerades efter 8 timmars behandling, och deras antal ökade efter 12 timmar. Flera stora vakuoler observerades efter 14 timmar. Flera sammansmälta vakuoler var tydligt synliga efter 12–16 timmars behandling, vilket indikerar att vakuolfusion är grunden för den metanogena dödsmekanismen. Efter 20 timmar hittades flera jättevakuoler i hela masken. Dessa observationer representerar den första rapporten om metuos i C. elegans.
Hos maskar behandlade med 5-jodoindol observerades även vakuolaggregation och bristning (Fig. 5), vilket framgår av maskböjning och vakuolfrisättning i omgivningen. Vakuolstörning observerades också i äggskalmembranet, vilket normalt bevaras intakt av L2 under kläckning (kompletterande Fig. S2). Dessa observationer stöder inblandningen av vätskeansamling och osmoregulatoriskt fel, såväl som reversibel cellskada (RCI), i processen för vakuolbildning och varbildning (Fig. 5).
Genom att anta jodens roll i den observerade vakuolbildningen undersökte vi den nematicida aktiviteten hos natriumjodid (NaI) och kaliumjodid (KI). Vid koncentrationer (0,1, 0,5 eller 1 mM) påverkade de dock inte varken nematodöverlevnad eller vakuolbildning (kompletterande figur S5), även om 1 mM KI hade en liten nematicidal effekt. Å andra sidan inducerade 7-jodindol (1 eller 2 mM), liksom 5-jodindol, flera vakuoler och strukturella deformationer (kompletterande figur S6). De två jodindolerna uppvisade liknande fenotypiska egenskaper i tallnematoder, medan NaI och KI inte gjorde det. Intressant nog inducerade indol inte vakuolbildning i B. xylophilus vid de testade koncentrationerna (data visas ej). Resultaten bekräftade således att indol-jodkomplexet är ansvarigt för vakuoliseringen och metabolismen av B. xylophilus.
Bland de indoler som testades för nematicid aktivitet hade 5-jodoindol det högsta slipindexet på -5,89 kcal/mol, följt av 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindol (-4,33) och indol (-4,03) (Figur 6). Den starka vätebindningen i huvudkedjan mellan 5-jodoindol och leucin 218 stabiliserar dess bindning, medan alla andra indolderivat binder till serin 260 via sidokedjevätebindningar. Bland andra modellerade jodoindoler har 2-jodoindol ett bindningsvärde på -5,248 kcal/mol, vilket beror på dess huvudsakliga vätebindning med leucin 218. Andra kända bindningar inkluderar 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,0 kcal/mol) och 6-fluorindol (-2,6 kcal/mol) (kompletterande figur S8). De flesta halogenerade indoler och indol i sig, med undantag för 5-jodoindol och 2-jodoindol, bildar en bindning med serin 260. Det faktum att vätebindning med leucin 218 indikerar effektiv receptor-ligandbindning, vilket observerats för ivermektin (kompletterande figur S7), bekräftar att 5-jodoindol och 2-jodoindol, liksom ivermektin, binder tätt till det aktiva sätet på GluCL-receptorn via leucin 218 (figur 6 och kompletterande figur S8). Vi föreslår att denna bindning krävs för att bibehålla den öppna porstrukturen i GluCL-komplexet och att genom att binda tätt till det aktiva sätet på GluCL-receptorn, 5-jodoindol, 2-jodindol, avermektin och ivermektin således bibehåller jonkanalen öppen och tillåter vätskeupptag.
Molekylär dockning av indol och halogenerad indol till GluCL. Bindningsorienteringar för (A) indol-, (B) 4-fluorindol-, (C) 7-jodoindol- och (D) 5-jodoindolligander till det aktiva sätet för GluCL. Proteinet representeras av ett band, och vätebindningarna i ryggradskedjan visas som gula prickade linjer. (A′), (B′), (C′) och (D′) visar interaktionerna mellan motsvarande ligander och de omgivande aminosyraresterna, och vätebindningarna i sidokedjorna indikeras med rosa prickade pilar.
Experiment utfördes för att utvärdera den toxiska effekten av 5-jodoindol på groningen av kål- och rädisfrön. 5-jodoindol (0,05 eller 0,1 mM) eller avermektin (10 μg/ml) hade liten eller ingen effekt på initial groning och plantornas uppkomst (Figur 7). Dessutom hittades ingen signifikant skillnad mellan groningshastigheten hos obehandlade kontroller och frön behandlade med 5-jodoindol eller avermektin. Effekten på pålrotförlängning och antalet bildade laterala rötter var obetydlig, även om 1 mM (10 gånger dess aktiva koncentration) av 5-jodoindol något fördröjde utvecklingen av laterala rötter. Dessa resultat indikerar att 5-jodoindol är giftfritt för växtceller och inte stör växternas utvecklingsprocesser vid de studerade koncentrationerna.
Effekt av 5-jodoindol på frögroning. Groning, spiring och lateral rotning av B. oleracea- och R. raphanistrum-frön på Murashige- och Skoog-agarmedium med eller utan avermektin eller 5-jodoindol. Groning registrerades efter 3 dagars inkubation vid 22°C.
Denna studie rapporterar flera fall av nematoddödning av indoler. Viktigt är att detta är den första rapporten om jodoindol som inducerar metylering (en process som orsakas av ansamling av små vakuoler som gradvis övergår till jättevakuoler, vilket så småningom leder till membranruptur och död) i tallbarr, där jodoindol uppvisar signifikanta nematodödande egenskaper som liknar dem hos det kommersiella nematiciden avermektin.
Det har tidigare rapporterats att indoler utövar flera signalfunktioner i prokaryoter och eukaryoter, inklusive biofilmhämning/bildning, bakteriell överlevnad och patogenicitet19,32,33,34. Nyligen har de potentiella terapeutiska effekterna av halogenerade indoler, indolalkaloider och semisyntetiska indolderivat väckt omfattande forskningsintresse35,36,37. Till exempel har halogenerade indoler visat sig döda persistenta Escherichia coli- och Staphylococcus aureus-celler37. Dessutom är det av vetenskapligt intresse att studera effekten av halogenerade indoler mot andra arter, släkten och riken, och denna studie är ett steg mot att uppnå detta mål.
Här föreslår vi en mekanism för 5-jodoindol-inducerad dödlighet i C. elegans baserad på reversibel cellskada (RCI) och metylering (Figur 4C och 5). Ödematösa förändringar såsom svullnader och vakuolär degeneration är indikatorer på RCI och metylering, manifesterade som jättevakuoler i cytoplasman48,49. RCI stör energiproduktionen genom att minska ATP-produktionen, orsaka fel i ATPas-pumpen, eller störa cellmembranen och orsaka ett snabbt inflöde av Na+, Ca2+ och vatten50,51,52. Intracytoplasmatiska vakuoler uppstår i djurceller som ett resultat av vätskeansamling i cytoplasman på grund av inflödet av Ca2+ och vatten53. Intressant nog är denna mekanism för cellskada reversibel om skadan är tillfällig och cellerna börjar producera ATP under en viss tidsperiod, men om skadan kvarstår eller förvärras dör cellerna.54 Våra observationer visar att nematoder som behandlats med 5-jodoindol inte kan återställa normal biosyntes efter exponering för stressförhållanden.
Metyleringsfenotypen som induceras av 5-jodoindol i B. xylophilus kan bero på närvaron av jod och dess molekylära distribution, eftersom 7-jodoindol hade mindre hämmande effekt på B. xylophilus än 5-jodoindol (tabell 1 och kompletterande figur S6). Dessa resultat överensstämmer delvis med studierna av Maltese et al. (2014), som rapporterade att translokation av pyridylkvävedelen i indol från para- till meta-positionen avskaffade vakuolisering, tillväxthämning och cytotoxicitet i U251-celler, vilket tyder på att molekylens interaktion med ett specifikt aktivt ställe i proteinet är kritisk27,44,45. Interaktionerna mellan indol eller halogenerade indoler och GluCL-receptorer som observerades i denna studie stöder också denna uppfattning, eftersom 5- och 2-jodoindol visade sig binda starkare till GluCL-receptorer än de andra undersökta indolerna (figur 6 och kompletterande figur S8). Jodet vid indolens andra eller femte position visade sig binda till leucin 218 på GluCL-receptorn via vätebindningar i huvudkedjan, medan andra halogenerade indoler och indol självt bildar svaga sidokedjevätebindningar med serin 260 (Figur 6). Vi spekulerar därför i att halogenens lokalisering spelar en viktig roll i induktionen av vakuolär degeneration, medan den starka bindningen av 5-jodindol håller jonkanalen öppen, vilket möjliggör snabb vätskeinflöde och vakuolruptur. Den detaljerade verkningsmekanismen för 5-jodindol återstår dock att fastställa.
Innan praktisk tillämpning av 5-jodoindol bör dess toxiska effekt på växter analyseras. Våra frögroningsexperiment visade att 5-jodoindol inte hade någon negativ effekt på frögroning eller efterföljande utvecklingsprocesser vid de studerade koncentrationerna (Figur 7). Denna studie ger således en grund för användningen av 5-jodoindol i den ekologiska miljön för att kontrollera tallnematoders skadlighet för tallar.
Tidigare rapporter har visat att indolbaserad behandling representerar en potentiell metod för att hantera problemet med antibiotikaresistens och cancerprogression55. Dessutom har indoler antibakteriella, anticancerösa, antioxidanta, antiinflammatoriska, antidiabetiska, antivirala, antiproliferativa och antituberkulosegenskaper och kan tjäna som en lovande grund för läkemedelsutveckling56,57. Denna studie antyder för första gången potentiell användning av jod som ett antiparasitiskt och avmaskningsmedel.
Avermektin upptäcktes för tre decennier sedan och vann Nobelpriset 2015, och dess användning som avmaskningsmedel pågår fortfarande aktivt. På grund av den snabba utvecklingen av resistens mot avermektiner hos nematoder och skadeinsekter behövs dock en alternativ, billig och miljövänlig strategi för att kontrollera tallvedsnematodinfektion i tallar. Denna studie rapporterar också mekanismen genom vilken 5-jodindol dödar tallnematoder och att 5-jodindol har låg toxicitet för växtceller, vilket öppnar goda möjligheter för dess framtida kommersiella tillämpning.
Alla experiment godkändes av etikkommittén vid Yeungnam University, Gyeongsan, Korea, och metoderna utfördes i enlighet med riktlinjerna från etikkommittén vid Yeungnam University.
Ägginkubationsexperiment utfördes med etablerade procedurer43. För att bedöma kläckningsfrekvensen (HR) överfördes 1 dag gamla vuxna nematoder (cirka 100 honor och 100 hanar) till petriskålar innehållande svampen och fick växa i 24 timmar. Äggen isolerades sedan och behandlades med 5-jodoindol (0,05 mM och 0,1 mM) eller avermektin (10 μg/ml) som en suspension i sterilt destillerat vatten. Dessa suspensioner (500 μl; cirka 100 ägg) överfördes till brunnarna i en 24-brunns vävnadsodlingsplatta och inkuberades vid 22 °C. L2-räkningar gjordes efter 24 timmars inkubation men ansågs döda om cellerna inte rörde sig när de stimulerades med en fin platinatråd. Detta experiment genomfördes i två steg, vart och ett med sex repetitioner. Data från båda experimenten kombinerades och presenterades. Procentandelen HR beräknas enligt följande:
Larvdödligheten bedömdes med hjälp av tidigare utvecklade procedurer. Nematodägg samlades in och embryon synkroniserades genom kläckning i sterilt destillerat vatten för att generera larver i L2-stadiet. Synkroniserade larver (cirka 500 nematoder) behandlades med 5-jodoindol (0,05 mM och 0,1 mM) eller avermektin (10 μg/ml) och odlades upp på B. cinerea Petri-plattor. Efter 48 timmars inkubation vid 22 °C samlades nematoderna in i sterilt destillerat vatten och undersöktes med avseende på förekomst av L2-, L3- och L4-stadierna. Närvaron av L3- och L4-stadierna indikerade larvtransformation, medan förekomsten av L2-stadiet indikerade ingen transformation. Bilder erhölls med hjälp av iRiS™ Digital Cell Imaging System. Detta experiment genomfördes i två steg, vart och ett med sex repetitioner. Data från båda experimenten kombinerades och presenterades.
Toxiciteten hos 5-jodoindol och avermektin för frön bedömdes med hjälp av groningstester på Murashige- och Skoog-agarplattor.62 Frön från B. oleracea och R. raphanistrum blötlades först i sterilt destillerat vatten i en dag, tvättades med 1 ml 100 % etanol, steriliserades med 1 ml 50 % kommersiellt blekmedel (3 % natriumhypoklorit) i 15 minuter och tvättades fem gånger med 1 ml sterilt vatten. De steriliserade fröna pressades sedan på groningsagarplattor innehållande 0,86 g/l (0,2X) Murashige- och Skoog-medium och 0,7 % bakteriologisk agar med eller utan 5-jodoindol eller avermektin. Plattorna inkuberades sedan vid 22 °C och bilder togs efter 3 dagars inkubation. Detta experiment genomfördes i två steg, som vart och ett hade sex upprepningar.
Publiceringstid: 26 februari 2025