Tack för att du besöker Nature.com.Den version av webbläsaren du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa resultat rekommenderar vi att du använder en nyare version av din webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa kontinuerlig support, visar vi webbplatsen utan styling eller JavaScript.
Upptäckten och fördelaktig användning av naturliga produkter kan bidra till att förbättra människors liv.Växttillväxthämmande kemikalier används i stor utsträckning som herbicider för att bekämpa ogräs.På grund av behovet av att använda olika typer av herbicider finns det ett behov av att identifiera föreningar med nya verkningsmekanismer.I denna studie upptäckte vi en ny N-alkoxipyrrolförening, kumamonamid, från Streptomyces werraensis MK493-CF1 och etablerade den fullständiga syntesprocessen.Genom biologiska aktivitetsanalyser upptäckte vi att urs-monoaminsyra är en syntetisk mellanprodukt av urs-monoamid och en potentiellväxttillväxthämmare.Dessutom har vi utvecklat olika urbenonsyraderivat, inklusive urbenyloxiderivatet (UDA), som har hög herbicid aktivitet utan att negativt påverka tillväxten av HeLa-celler.Vi fann också att urmotonsyraderivat stör växternas mikrotubuli;dessutom påverkar KAND aktinfilament och inducerar celldöd;Dessa mångfacetterade effekter skiljer sig från de hos kända mikrotubuli-hämmare och föreslår en ny verkningsmekanism för ursonsyra, som representerar en viktig fördel vid utvecklingen av nya herbicider.
Upptäckten och den praktiska tillämpningen av välgörande naturprodukter och deras derivat är ett sätt att förbättra människors livskvalitet.Sekundära metaboliter som produceras av mikroorganismer, växter och insekter har lett till stora framsteg inom medicin och jordbruk.Många antibiotika och läkemedel mot leukemi har utvecklats från naturliga produkter.Dessutom olika typer avbekämpningsmedel, fungicider och herbicider extraheras från dessa naturprodukter för användning inom jordbruket.Särskilt ogräsbekämpningsmedel är viktiga verktyg för att öka skörden i modernt jordbruk, och olika typer av föreningar används redan kommersiellt.Flera cellulära processer i växter, såsom fotosyntes, aminosyrametabolism, cellväggssyntes, reglering av mitos, fytohormonsignalering eller proteinsyntes, anses vara typiska mål för herbicider.Föreningar som hämmar mikrotubulifunktionen är en vanlig klass av herbicider som påverkar växttillväxt genom att påverka mitotisk reglering2.
Mikrotubuli är komponenter i cytoskelettet och är allmänt bevarade i eukaryota celler.Tubulinheterodimeren består av α-tubulin och β-tubulin som bildar linjära mikrotubuliprotofilament, med 13 protofilament som bildar en cylindrisk struktur.Mikrotubuli spelar flera roller i växtceller, inklusive bestämning av cellform, celldelning och intracellulär transport3,4.Växtceller innehåller mikrotubuli under interfasplasmamembranet, och dessa så kallade kortikala mikrotubuli tros styra organiseringen av cellulosamikrofibriller genom reglering av cellulosasyntaskomplex4,5.Kortikala mikrotubuli av rotepidermala celler, närvarande i zonen med snabb förlängning av rotspetsen, är belägna i sidled, och cellulosamikrofibrer följer dessa mikrotubuli och begränsar riktningen för cellexpansion, vilket främjar anisotrop cellförlängning.Därför är mikrotubulus funktion nära relaterad till växtmorfologi.Aminosyrasubstitutioner i gener som kodar för tubulin orsakar skevhet av kortikala mikrotubuli-arrayer och vänster- eller högersidig tillväxt i Arabidopsis 6,7.På liknande sätt kan mutationer i mikrotubuli-associerade proteiner som reglerar mikrotubulidynamiken också leda till förvrängd rottillväxt8,9,10,11,12,13.Dessutom orsakar behandling med mikrotubulusstörande herbicider som disopyramid, även känd som pretilaklor, även vänstersidig sned rottillväxt14.Dessa data indikerar att exakt reglering av mikrotubulus funktion är avgörande för att bestämma riktningen för växttillväxt.
Olika typer av mikrotubuli-hämmare har upptäckts, och dessa läkemedel har gett betydande bidrag till cytoskelettforskningen, såväl som till jordbruk och medicin2.I synnerhet kan oryzalin, dinitroanilinföreningar, disopyramid, bensamidrelaterade föreningar och deras analoger hämma mikrotubulifunktionen och därigenom hämma växttillväxt.Därför används de i stor utsträckning som ogräsmedel.Men eftersom mikrotubuli är en viktig komponent i växt- och djurceller är de flesta mikrotubulihämmare cytotoxiska för båda celltyperna.Därför, trots deras erkända användbarhet som herbicider, används ett begränsat antal antimikrotubulimedel för praktiska ändamål.
Streptomyces är ett släkte av familjen Streptomyces, som inkluderar aeroba, grampositiva, filamentösa bakterier och är allmänt känt för sin förmåga att producera ett brett spektrum av sekundära metaboliter.Därför anses det vara en av de viktigaste källorna till nya biologiskt aktiva naturprodukter.I den aktuella studien upptäckte vi en ny förening som heter kumamonamid, som isolerades från Streptomyces werraensis MK493-CF1 och S. werraensis ISP 5486. Med hjälp av spektralanalys och fullständig spektralanalys karakteriserades strukturen av kumamonamid och dess unika N-alkoxipyrrolskelett. var besluten.syntes.Ursmonsyra, en syntetisk mellanprodukt av ursmonoamid och dess derivat, visade sig hämma tillväxten och groningen av den populära modellväxten Arabidopsis thaliana.I en struktur-aktivitetsstudie fann vi att en förening med C9 modifierad till ursonsyra, kallad nonyloxiderivat av ursonsyra (KAND), signifikant förstärker den hämmande effekten på tillväxt och groning.Noterbart är att den nyupptäckta växttillväxthämmaren också påverkade tillväxten av tobak och levermos och var inte cytotoxisk för bakterier eller HeLa-celler.Dessutom inducerar vissa urmotonsyraderivat en förvrängd rotfenotyp, vilket antyder att dessa derivat direkt eller indirekt påverkar mikrotubuli.I enlighet med denna idé indikerar våra observationer av mikrotubuli märkta antingen immunhistokemiskt eller med fluorescerande proteiner att KAND-behandling depolymeriserar mikrotubuli.Dessutom störde behandling med kumamotonsyraderivat aktinmikrofilament.Således har vi upptäckt en ny växttillväxthämmare vars unika verkningsmekanism innebär förstörelse av cytoskelettet.
Stammen MK493-CF1 isolerades från jord i Shinagawa-ku, Tokyo.Stammen MK493-CF1 bildade välgrenat stromalt mycelium.Den partiella sekvensen av 16S ribosomala RNA-genen (1422 bp) bestämdes.Denna stam är mycket lik S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typisk stam, 99,93%).Baserat på detta resultat fastställdes det att denna stam var nära besläktad med typen av S. werraensis.Därför namngav vi provisoriskt denna stam S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T producerar också samma bioaktiva föreningar.Eftersom det tidigt fanns lite forskning om att få naturliga produkter från denna mikroorganism, genomfördes ytterligare kemisk forskning.Efter odling av S. werraensis MK493-CF1 på kornmedium genom jäsning i fast tillstånd vid 30°C under 14 dagar, extraherades mediet med 50 % EtOH.60 ml prov torkades för att erhålla 59,5 mg råextrakt.Det råa extraktet utsattes för omvänd fas HPLC för att ge N-metoxi-lH-pyrrol-2-karboxamid (1, benämnd kumamonamid, 36,0 mg).Den totala mängden 1 är ungefär 60 % av råextraktet.Därför bestämde vi oss för att i detalj studera egenskaperna hos kumamotoamid 1.
Coumamonamide 1 är ett vitt amorft pulver och högupplöst masspektrometri (HRESIMS) bekräftar C6H8N2O2 (Fig. 1).Det C2-substituerade pyrrolfragmentet av denna förening kännetecknas av δH 6,94 (IH, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH i IH NMR-spektrum: 4,5 Hz , H-5) och 5H 6,78 (IH, d, J = 2,5 Hz, H-6), och 13C NMR-spektrumet visar närvaron av fyra sp2-kolatomer.Närvaron av en amidgrupp vid C2-positionen bedömdes genom HMBC-korrelation från C-3-protonen till amidkarbonylkolet vid δC 161,1.Dessutom indikerar 1H och 13C NMR-toppar vid δH 4,10 (3H, S) och δC 68,3 närvaron av N-metoxigrupper i molekylen.Även om den korrekta positionen för metoxigruppen ännu inte hade bestämts med användning av spektroskopisk analys såsom förstärkt differensspektroskopi och nukleär Overhauser-förkortning (NOEDF), blev N-metoxi-1H-pyrrol-2-karboxamid den första kandidatföreningen.
För att bestämma den korrekta strukturen av 1 utfördes en total syntes (Fig. 2a).Behandling av kommersiellt tillgänglig 2-aminopyridin 2 med m-CPBA resulterade i motsvarande N-oxid 3 i kvantitativt utbyte.Efter 2-aminoazideringen av 2 utfördes cyklokondensationsreaktionen beskriven av Abramovich i bensen vid 90°C för att erhålla den önskade 1-hydroxi-lH-pyrrol-2-karbonitril 5 i gram.Hastighet 60% (två steg).15,16.Metylering och hydrolys av 4 gav sedan 1-metoxi-lH-pyrrol-2-karboxylsyra (betecknad "cumotonsyra", 6) i bra utbyte (70 %, två steg).Slutligen gav amidering via syrakloridmellanprodukt 6 med användning av vattenhaltig ammoniak Kumamoto-amid 1 i 98 % utbyte.Alla spektraldata för syntetiserad 1 liknade isolerad 1, så strukturen för 1 bestämdes;
Allmän syntes och analys av den biologiska aktiviteten av urbenamid och urbensyra.(a) Total syntes av Kumamoto-amid.(b) Sju dagar gamla vildtyp Arabidopsis Columbia (Col) plantor odlades på Murashige och Skoog (MS) plattor innehållande coumamonamide 6 eller coumamonamide 1 vid de angivna koncentrationerna.Skalstång = 1 cm.
Först utvärderade vi de biologiska aktiviteterna av urbenamid och dess intermediärer för deras förmåga att modulera växttillväxt.Vi tillsatte olika koncentrationer av ursmonamid 1 eller ursmonsyra 6 till MS-agarmedium och odlade Arabidopsis thaliana-plantor på detta medium.Dessa analyser visade att höga koncentrationer (500 μM) av 6 hämmade rottillväxt (Fig. 2b).Därefter genererade vi olika derivat genom att ersätta N1-positionen på 6 och utförde studier av struktur-aktivitetssamband på dem (den analoga syntesprocessen beskrivs i Supporting Information (SI)).Arabidopsis plantor odlades på ett medium innehållande 50 μM ursonsyraderivat, och rotlängden mättes.som det visas på bilden.Såsom visas i figurerna 3a, b och S1 har coumamosyror olika längder av linjära alkoxikedjor (9, 10, 11, 12 och 13) eller stora alkoxikedjor (15, 16 och 17) vid N1-positionen.Derivaten visade signifikant hämning av rottillväxt.Dessutom fann vi att tillämpning av 200 μM 10, 11 eller 17 hämmade groning (fig. 3c och S2).
Studie av struktur-aktivitetsförhållandet mellan Kumamotoamid och relaterade föreningar.(a) Struktur och syntesschema för analoger.(b) Kvantifiering av rotlängden för 7 dagar gamla plantor odlade på MS-medium med eller utan 50 μM kumamonamidderivat.Asterisker indikerar signifikanta skillnader med skenbehandling (t-test, sid< 0,05).n>18. Data visas som medelvärde ± SD.nt betyder "ej testad" eftersom mer än 50 % av fröna inte grodde.(c) Kvantifiering av grobarheten för behandlade frön inkuberade i 7 dagar i MS-medium med eller utan 200 μM kumamonamid och relaterade föreningar.Asterisker indikerar signifikanta skillnader med skenbehandling (chi-square test).n=96.
Intressant nog minskade tillägget av alkylsidokedjor längre än C9 den hämmande aktiviteten, vilket tyder på att kumamotoinsyrarelaterade föreningar kräver sidokedjor av en viss storlek för att uppvisa sin biologiska aktivitet.
Eftersom struktur-aktivitetssambandsanalys visade att C9 modifierades till ursonsyra och nonyloxiderivatet av ursonsyra (hädanefter kallat KAND 11) var den mest effektiva växttillväxthämmaren, genomförde vi en mer detaljerad karakterisering av KAND 11. Behandling av Arabidopsis med 50 μM KAND 11 nästan helt förhindrade groning, medan lägre koncentrationer (40, 30, 20 eller 10 μM) av KAND 11 hämmade rottillväxt på ett dosberoende sätt (Fig. 4a, b).För att testa om KAND 11 påverkar rotmeristems viabilitet undersökte vi rotmeristem färgade med propidiumjodid (PI) och mätte meristemareans storlek.Storleken på meristemet hos plantor som odlats på ett medium innehållande 25 μM KAND-11 var 151,1 ± 32,5 μm, medan storleken på meristemet för plantor odlade på ett kontrollmedium innehållande DMSO var 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d) , vilket indikerar att KAND-11 återställer cellulär aktivitet.spridning.Rotmeristem.I enlighet med detta minskade KAND 11-behandling mängden celldelningsmarkör CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-signal i rotmeristemet (Fig. 4e) 17 .Dessa resultat indikerar att KAND 11 hämmar rottillväxt genom att reducera cellproliferationsaktivitet.
Analys av den hämmande effekten av urbenonsyraderivat (urbenyloxiderivat) på tillväxt.(a) 7 dagar gamla Col-plantor av vildtyp odlade på MS-plattor med de angivna koncentrationerna av KAND 11. Skalstång = 1 cm.(b) Kvantifiering av rotlängd.Bokstäver indikerar signifikanta skillnader (Tukey HSD-test, sid< 0,05).n>16. Data visas som medelvärde ± SD.(c) Konfokalmikroskopi av propidiumjodid-färgade vildtyp Col-rötter odlade på MS-plattor med eller utan 25 μM KAND 11. Vita parenteser indikerar rotmeristem.Skalstång = 100 µm.(d) Kvantifiering av rotmeristemstorlek (n = 10 till 11).Statistiska skillnader bestämdes med hjälp av t-test (s< 0,05).Staplarna representerar den genomsnittliga meristemstorleken.(e) Differentialinterferenskontrast (DIC) mikroskopi av ett rotmeristem innehållande CDKB2-konstruktionen;1pro: CDKB2;1-GUS färgad och färgad på 5 dagar gamla plantor odlade på MS-plattor med eller utan 25 µM KAND-analys.
Fytotoxiciteten hos KAND 11 testades ytterligare med användning av en annan tvåhjärtbladig växt, tobak (Nicotiana tabacum), och en viktig landväxtmodellorganism, levermos (Marchantia polymorpha).Som i fallet med Arabidopsis producerade tobaks SR-1 plantor odlade på medium innehållande 25 μM KAND 11 kortare rötter (Fig. 5a).Dessutom grodde 40 av 48 frön på plattor innehållande 200 μM KAND 11, medan alla 48 frön grodde på skenbehandlade medier, vilket indikerar att högre koncentrationer av KAND var signifikanta (p< 0,05;chi test -square) hämmade tobakens groning.(Fig. 5b).Dessutom var koncentrationen av KAND 11 som hämmade bakterietillväxt i levermos liknande den effektiva koncentrationen i Arabidopsis (Fig. 5c).Dessa resultat indikerar att KAND 11 kan hämma tillväxten av en mängd olika växter.Vi undersökte sedan den möjliga cytotoxiciteten hos björnmonoamidrelaterade föreningar i andra organismer, nämligen humana HeLa-celler och Escherichia coli-stam DH5α, som representanter för högre djur- respektive bakterieceller.I en serie cellproliferationsanalyser observerade vi att kumamonamid 1, kumamonamidsyra 6 och KAND 11 inte påverkade tillväxten av HeLa- eller E. coli-celler vid koncentrationer av 100 μM (Fig. 5d, e).
Tillväxthämning av KAND 11 i icke-Arabidopsis-organismer.(a) Två veckor gamla vildtyp SR-1 tobaksplantor odlades på vertikalt placerade MS-plattor innehållande 25 μM KAND 11. (b) Två veckor gamla vildtyp SR-1 tobaksplantor odlades på horisontellt placerade MS-plattor innehållande 200 μM KAND 11. (c) Två veckor gamla vildtyp Tak-1 levermossknoppar odlade på Gamborg B5-plattor med de angivna koncentrationerna av KAND 11. Röda pilar indikerar sporer som slutade växa under två veckors inkubation period.(d) Cellproliferationsanalys av HeLa-celler.Antalet livsdugliga celler mättes med fasta tidsintervall med användning av ett cellräkningskit 8 (Dojindo).Som kontroll behandlades HeLa-celler med 5 μg/ml aktinomycin D (Act D), som hämmar RNA-polymeras transkription och orsakar celldöd.Analyser utfördes i tre exemplar.(e) E. coli cellproliferationsanalys.E. coli-tillväxt analyserades genom att mäta OD600.Som kontroll behandlades celler med 50 μg/ml ampicillin (Amp), som hämmar bakteriell cellväggssyntes.Analyser utfördes i tre exemplar.
För att dechiffrera verkningsmekanismen för cytotoxicitet orsakad av uramidrelaterade föreningar, analyserade vi om urbensyraderivat med måttliga hämmande effekter.som det visas på bilden.Som visas i figur 2b, 6a producerade plantor odlade på agarplattor innehållande höga koncentrationer (200 μM) av urmotonsyra 6 kortare och vänsterkrökta rötter (θ = – 23,7 ± 6,1), medan plantor som odlats på kontrollmediet, plantor producerade nästan raka rötter (θ = – 3,8 ± 7,1).Denna karakteristiska sneda tillväxt är känd för att bero på dysfunktion av kortikala mikrotubuli14,18.I enlighet med detta fynd inducerade de mikrotubuli-destabiliserande läkemedlen disopyramid och oryzalin liknande rottiltning under våra tillväxtförhållanden (fig. 2b, 6a).Samtidigt testade vi urmotonsyraderivat och valde ut flera av dem som vid vissa koncentrationer inducerade sned rottillväxt.Föreningarna 8, 9 och 15 ändrade rottillväxtriktningen vid 75 μM, 50 μM respektive 40 μM, vilket indikerar att dessa föreningar effektivt kan destabilisera mikrotubuli (Fig. 2b, 6a).Vi testade också det mest potenta ursolsyraderivatet, KAND 11, vid en lägre koncentration (15 µM) och fann att applicering av KAND 11 hämmade rottillväxt och att rottillväxtriktningen var ojämn, även om de tenderade att slutta åt vänster ( Figur C3)..Eftersom högre koncentrationer av mikrotubuli-destabiliserande läkemedel ibland hämmar växttillväxt snarare än orsakar rottiltning, bedömde vi därefter möjligheten att KAND 11 påverkar mikrotubuli genom att observera kortikala mikrotubuli i rotepidermala celler.Immunhistokemi med användning av anti-β-tubulinantikroppar i epidermala celler från plantrötter behandlade med 25 μM KAND 11 visade försvinnandet av nästan alla kortikala mikrotubuli i epidermala celler i förlängningszonen (Fig. 6b).Dessa resultat indikerar att kumamotonsyra och dess derivat verkar direkt eller indirekt på mikrotubuli för att störa dem och att dessa föreningar är nya mikrotubulihämmare.
Ursonsyra och dess derivat förändrar kortikala mikrotubuli i Arabidopsis thaliana.(a) Rotlutningsvinkel mätt i närvaro av olika urmotonsyraderivat vid de angivna koncentrationerna.Effekterna av två föreningar som är kända för att hämma mikrotubuli: disopyramid och oryzalin analyserades också.Insatsen visar standarden som används för att mäta rottillväxtvinkeln.Asterisker indikerar signifikanta skillnader med skenbehandling (t-test, sid< 0,05).n>19. Skalstav = 1 cm.(b) Kortikala mikrotubuli i epidermala celler i förlängningszonen.Mikrotubuli i vildtyp Arabidopsis Col-rötter odlade på MS-plattor med eller utan 25 μM KAND 11 visualiserades genom immunhistokemisk färgning med β-tubulin primära antikroppar och Alexa Fluor-konjugerade sekundära antikroppar.Skalstång = 10 µm.(c) Mitotisk struktur av mikrotubuli i rotmeristemet.Mikrotubuli visualiserades med användning av immunhistokemisk färgning.Mitotiska strukturer, inklusive profaszoner, spindlar och fragmoplaster, räknades från konfokala bilder.Pilar indikerar mitotiska mikrotubulistrukturer.Asterisker indikerar signifikanta skillnader med skenbehandling (t-test, sid< 0,05).n>9. Skalstång = 50 µm.
Även om Ursa har förmågan att störa mikrotubulus funktion, förväntas dess verkningsmekanism vara annorlunda än typiska mikrotubuli-depolymeriseringsmedel.Till exempel inducerar högre koncentrationer av mikrotubuli-depolymeriseringsmedel såsom disopyramid och oryzalin anisotrop expansion av epidermala celler, medan KAND 11 inte gör det.Dessutom resulterade samapplicering av KAND 11 och disopyramid i ett kombinerat disopyramid-inducerat rottillväxtsvar och KAND 11-inducerad tillväxthämning observerades (Fig. S4).Vi analyserade också responsen från den överkänsliga disopyramid 1-1 (phs1-1) mutanten på KAND 11. phs1-1 har en icke-kanonisk tubulinkinaspunktmutation och producerar kortare rötter när den behandlas med disopyramid9,20.phs1-1 muterade plantor odlade på agarmedium innehållande KAND 11 hade kortare rötter liknande de som odlades på disopyramid (fig. S5).
Dessutom observerade vi mitotiska mikrotubulistrukturer, såsom profaszoner, spindlar och fragmoplaster, i rotmeristem hos plantor som behandlats med KAND 11. I överensstämmelse med observationerna för CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, en signifikant minskning av antalet mitotiska mikrotubuli observerades (Fig. .6c).
För att karakterisera cytotoxiciteten hos KAND 11 vid subcellulär upplösning, behandlade vi tobaks BY-2 suspensionsceller med KAND 11 och observerade deras svar.Vi lade först till KAND 11 till BY-2-celler som uttrycker TagRFP-TUA6, som fluorescerande märker mikrotubuli, för att bedöma effekten av KAND 11 på kortikala mikrotubuli.Kortikal mikrotubuli densitet bedömdes med hjälp av bildanalys, som kvantifierade andelen cytoskelettpixlar bland cytoplasmatiska pixlar.Analysresultaten visade att efter behandling med 50 μM eller 100 μM KAND 11 under 1 timme, minskade densiteten signifikant till 0,94 ± 0,74 % respektive 0,23 ± 0,28 %, medan densiteten av celler behandlade med DMSO uppgick till 61 ± 10 . % (fig. 7a).Dessa resultat överensstämmer med observationen i Arabidopsis att KAND 11-behandling inducerar depolymerisation av kortikala mikrotubuli (Fig. 6b).Vi undersökte också BY-2-linjen med GFP-ABD-märkta aktinfilament efter behandling med samma koncentration av KAND 11 och observerade att KAND 11-behandling störde aktinfilamenten.Behandling med 50 μM eller 100 μM KAND 11 under 1 timme minskade signifikant aktinfilamentdensiteten till 1,20 ± 0,62 % respektive 0,61 ± 0,26 %, medan densiteten i DMSO-behandlade celler var 1,69 % ± 0,69 %.7b).Dessa resultat står i kontrast till effekterna av propyzamid, som inte påverkar aktinfilament, och latrunculin B, en aktindepolymerisator som inte påverkar mikrotubuli (SI Figur S6).Dessutom påverkade inte behandling med kumamonamid 1, kumamonamidsyra 6 eller KAND 11 mikrotubuli i HeLa-celler (SI Figur S7).Verkningsmekanismen för KAND 11 tros således vara annorlunda än den för kända cytoskelettstörare.Dessutom avslöjade vår mikroskopiska observation av BY-2-celler behandlade med KAND 11 början av celldöd under KAND 11-behandling och visade att andelen Evans blåfärgade döda celler inte ökade signifikant efter 30 minuters KAND 11-behandling, medan efter 90 minuters behandling med 50 μM eller 100 μM KAND ökade antalet döda celler till 43,7 % respektive 80,1 % (fig. 7c).Sammantaget indikerar dessa data att det nya ursolsyraderivatet KAND 11 är en växtspecifik cytoskelettinhibitor med en tidigare okänd verkningsmekanism.
KAND påverkar kortikala mikrotubuli, aktinfilament och livsduglighet hos tobaks BY-2-celler.(a) Visualisering av kortikala mikrotubuli i BY-2-celler i närvaro av TagRFP-TUA6.BY-2-celler behandlade med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO undersöktes med konfokalmikroskopi.Kortikal mikrotubuli-densitet beräknades från mikrofotografier av 25 oberoende celler.Bokstäver indikerar signifikanta skillnader (Tukey HSD-test, sid< 0,05).Skalstång = 10 µm.(b) Kortikala aktinfilament i BY-2-celler visualiserade i närvaro av GFP-ABD2.BY-2-celler behandlade med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO undersöktes med konfokalmikroskopi.Tätheten av kortikala aktinfilament beräknades från mikrofotografier av 25 oberoende celler.Bokstäver indikerar signifikanta skillnader (Tukey HSD-test, sid< 0,05).Skalstång = 10 µm.(c) Observation av döda BY-2-celler genom Evans blå färgning.BY-2-celler behandlade med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO undersöktes med ljusfältsmikroskopi.n=3.Skalstång = 100 µm.
Upptäckten och tillämpningen av nya naturliga produkter har lett till betydande framsteg inom olika aspekter av mänskligt liv, inklusive medicin och jordbruk.Historisk forskning har utförts för att få fram användbara föreningar från naturresurser.I synnerhet är aktinomyceter kända för att vara användbara som antiparasitära antibiotika för nematoder på grund av deras förmåga att producera olika sekundära metaboliter såsom avermektin, huvudföreningen av ivermektin och bleomycin och dess derivat, som används medicinskt som ett anticancermedel21,22.Likaså har en mängd olika herbicida föreningar upptäckts från aktinomyceter, av vilka några redan används kommersiellt1,23.Därför anses analysen av aktinomycetmetaboliter för att isolera naturliga produkter med önskade biologiska aktiviteter som en effektiv strategi.I denna studie upptäckte vi en ny förening, coumamonamid, från S. werraensis och syntetiserade den framgångsrikt.Ursonsyra är en syntetisk mellanprodukt av urbenamid och dess derivat.Det kan orsaka karakteristisk rotkurning, uppvisa måttlig till stark herbicid aktivitet och direkt eller indirekt skada växternas mikrotubuli.Verkningsmekanismen för urmotonsyra kan dock skilja sig från den för befintliga mikrotubuli-hämmare, eftersom KAND 11 också stör aktinfilament och orsakar celldöd, vilket tyder på en regleringsmekanism genom vilken urmotonsyra och dess derivat påverkar ett brett spektrum av cytoskelettstrukturer..
Ytterligare detaljerad karakterisering av urbenonsyra kommer att hjälpa till att bättre förstå verkningsmekanismen för urbenonsyra.I synnerhet är nästa mål att utvärdera förmågan hos ursonsyra att binda till reducerade mikrotubuli för att avgöra om ursonsyra och dess derivat verkar direkt på mikrotubuli och depolymeriserar dem, eller om deras verkan resulterar i mikrotubuli destabilisering.Dessutom, i de fall där mikrotubuli inte är ett direkt mål, kommer identifiering av verkningsstället och molekylära mål för ursonsyra på växtceller att hjälpa till att ytterligare förstå egenskaperna hos relaterade föreningar och möjliga sätt att förbättra herbicid aktivitet.Vår bioaktivitetsanalys avslöjade den unika cytotoxiska förmågan hos ursonsyra på tillväxten av växter som Arabidopsis thaliana, tobak och levermos, medan varken E. coli eller HeLa-celler påverkades.Liten eller ingen toxicitet för djurceller är en fördel med ursonsyraderivat om de utvecklas som herbicider för användning i öppna jordbruksfält.Eftersom mikrotubuli är vanliga strukturer i eukaryoter, är deras selektiva hämning i växter ett nyckelkrav för herbicider.Till exempel används propyzamid, ett mikrotubuli-depolymeriseringsmedel som direkt binder till tubulin och hämmar polymerisation, som en herbicid på grund av dess låga toxicitet för djurceller24.I motsats till disopyramid har relaterade bensamider olika målspecificiteter.Förutom växtmikrotubuli hämmar RH-4032 eller bensoxamid även mikrotubuli av djurceller respektive oomyceter, och zalilamid används som en svampdödande medel på grund av dess låga fytotoxicitet25,26,27.Den nyupptäckta björnen och dess derivat uppvisar selektiv cytotoxicitet mot växter, men det är värt att notera att ytterligare modifieringar kan förändra deras målspecificitet, vilket potentiellt ger ytterligare derivat för kontroll av patogena svampar eller oomyceter.
De unika egenskaperna hos urbenonsyra och dess derivat är användbara för deras utveckling som herbicider och användning som forskningsverktyg.Cytoskelettets betydelse för att kontrollera växtcellformen är allmänt erkänd.Tidigare studier har visat att växter har utvecklat komplexa mekanismer för organisering av kortikala mikrotubuli genom att kontrollera mikrotubulus dynamik för att korrekt kontrollera morfogenesen.Ett stort antal molekyler som är ansvariga för regleringen av mikrotubuliaktivitet har identifierats, och relaterad forskning pågår fortfarande3,4,28.Vår nuvarande förståelse av mikrotubulus dynamik i växtceller förklarar inte helt mekanismerna för organisering av kortikal mikrotubuli.Till exempel, även om både disopyramid och oryzalin kan depolymerisera mikrotubuli, orsakar disopyramid allvarlig rotförvrängning medan oryzalin har en relativt mild effekt.Dessutom orsakar mutationer i tubulin, som stabiliserar mikrotubuli, även dextrorotation i rötter, medan paklitaxel, som också stabiliserar mikrotubulidynamiken, inte gör det.Därför bör studier och identifiering av de molekylära målen för ursolsyra ge nya insikter om regleringen av växtkortikala mikrotubuli.Likaså kommer framtida jämförelser av kemikalier som är effektiva för att främja snedvriden tillväxt, såsom disopyramid, och mindre effektiva kemikalier, såsom oryzalin eller kumamotorsyra, ge ledtrådar till hur förvrängd tillväxt uppstår.
Å andra sidan är försvarsrelaterade omarrangemang av cytoskelett en annan möjlighet att förklara cytotoxiciteten hos ursonsyra.Infektion av en patogen eller införande av en elicitor i växtceller orsakar ibland förstörelse av cytoskelettet och efterföljande celldöd29.Till exempel har oomycet-härlett kryptoxantin rapporterats störa mikrotubuli och aktinfilament före tobakscellsdöd, liknande det som inträffar med KAND-behandling30,31.Likheterna mellan försvarssvar och cellulära svar inducerade av ursonsyra ledde till att vi antog att de utlöser vanliga cellulära processer, även om en snabbare och starkare effekt av ursonsyra än kryptoxantin är uppenbar.Studier har dock visat att störningar av aktinfilament främjar spontan celldöd, som inte alltid åtföljs av mikrotubulusavbrott29.Dessutom återstår det att se om antingen patogenen eller framkallaren orsakar förvrängd rottillväxt, som ursonsyraderivat gör.Således är molekylär kunskap som kopplar samman försvarssvar och cytoskelettet ett attraktivt problem att ta itu med.Genom att utnyttja närvaron av lågmolekylära föreningar relaterade till ursonsyra, såväl som en rad derivat med varierande styrka, kan de ge möjligheter att rikta in sig på okända cellulära mekanismer.
Sammantaget kommer upptäckten och tillämpningen av nya föreningar som modulerar mikrotubulus dynamik att ge kraftfulla metoder för att ta itu med de komplexa molekylära mekanismerna som ligger till grund för bestämning av växtcellsform.I detta sammanhang kan den nyligen utvecklade föreningen urmotonsyra, som påverkar mikrotubuli och aktinfilament och inducerar celldöd, ge en möjlighet att dechiffrera sambandet mellan mikrotubulikontroll och dessa andra mekanismer.Således kommer kemisk och biologisk analys med urbenonsyra att hjälpa oss att förstå de molekylära regleringsmekanismerna som styr växtens cytoskelett.
Inokulera S. werraensis MK493-CF1 i en 500 mL förbryllad Erlenmeyer-kolv innehållande 110 mL frömedium bestående av 2 % (vikt/volym) galaktos, 2 % (vikt/volym) Essencepasta, 1 % (vikt/volym) Bacto-komposition .-sojaton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (vikt/volym) majsextrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2 % (vikt/volym) (NH4)2SO4 och 0,2 % CaCO3 i avjoniserat vatten.(pH 7,4 före sterilisering).Frökulturerna inkuberades på en roterande skakapparat (180 rpm) vid 27°C under 2 dagar.Produktionsodling via fast tillståndsjäsning.Frökulturen (7 ml) överfördes till en 500 ml K-1-kolv innehållande 40 g produktionsmedium bestående av 15 g pressat korn (MUSO Co., Ltd., Japan) och 25 g avjoniserat vatten (pH ej justerat före sterilisering).).Fermentering utfördes vid 30°C i mörker under 14 dagar.Fermentationsmaterialet extraherades med 40 ml/flaska EtOH och centrifugerades (1500 g, 4°C, 10 min).Odlingssupernatanten (60 ml) extraherades med en blandning av 10 % MeOH/EtOAc.Det organiska skiktet indunstades under reducerat tryck för att erhålla en återstod (59,5 mg), som utsattes för HPLC med gradienteluering (0–10 minuter: 90 %) på en omvänd faskolonn (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × längd 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuter: 90 % H2O/CH3CN till 70 % H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minuter: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minuter: 90 % H2O /EtOH till 100 % EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100 % EtOH) vid en flödeshastighet av 1,5 ml/min, kumamonamid (1, 36,0 mg) isolerades som ett vitt amorft pulver.
Kumamotoamid(1);'H-NMR (500 MHz, CDCI3) 5 6,93 (t, J = 2,5 Hz, IH), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz IH), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, IH).4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCI3) 5 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ beräknat värde: 141,0659, uppmätt värde: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 15 cm.
Columbia frön (Col-0) erhölls från Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) med tillstånd för forskningsanvändning.Col-0 frön förökades och bibehölls under våra laboratorieförhållanden och användes som Arabidopsis-växter av vildtyp.Arabidopsis-frön ytsteriliserades och odlades i halvstyrka Murashige och Skoog-medium innehållande 2 % sackaros (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (vikt/volym) 2-(4-morfolino)etansulfonsyra (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) och 1,5 % agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, vid 23 °C och konstant ljus.Frön av phs1-1-mutanten tillhandahölls av T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Frön av stam SR-1 tillhandahölls av T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) och användes som tobaksplantor av vildtyp.Tobaksfrön ytsteriliserades och blötlades i sterilt vatten i tre nätter för att främja groning, placerades sedan i en halvstyrka lösning innehållande 2 % sackaros, 0,05 % (vikt/volym) MES och 0,8 % gellangummi (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.och Skoog-medium) med pH 5,7 och inkuberades vid 23°C under konstant ljus.
Stam Tak-1 tillhandahölls av T. Kohchi (Kyoto University) och användes som standard experimentell enhet för levermossstudien.Gemma erhölls från steriliserade odlade växter och ströks sedan ut på Gamborg B5-medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) innehållande 1 % sackaros och 0,3 % gellangummi och inkuberades vid 23°C under kontinuerligt ljus.
Tobak BY-2-celler (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) tillhandahölls av S. Hasezawa (University of Tokyo).BY-2-celler späddes 95 gånger i modifierat Linsmeier- och Skoog-medium och kompletterades varje vecka med 2,4-diklorfenoxiättiksyra32.Cellsuspensionen blandades på en roterande skakapparat vid 130 rpm vid 27°C i mörker.Tvätta cellerna med 10 gånger volymen färskt medium och återsuspendera i samma medium.BY-2 transgena cellinjer som stabilt uttrycker mikrotubulusmarkören TagRFP-TUA6 eller aktinfilamentmarkören GFP-ABD2 under blomkålsmosaikvirus 35S-promotorn genererades enligt beskrivning33,34,35.Dessa cellinjer kan underhållas och synkroniseras med användning av procedurer liknande de som används för den ursprungliga BY-2-cellinjen.
HeLa-celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) (Life Technologies) kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 1,2 U/ml penicillin och 1,2 μg/ml streptomycin i en 37°C inkubator med 5% CO2.
Alla experiment som beskrivs i detta manuskript utfördes i enlighet med japanska biosäkerhetsföreskrifter och riktlinjer.
Föreningar löstes i dimetylsulfoxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) som stamlösningar och späddes i MS-medium för Arabidopsis och tobak eller Gamborg B5-medium för levermos.För rottillväxtinhiberingsanalysen såddes mer än 10 frön per platta på agarmedium innehållande de angivna föreningarna eller DMSO.Frön inkuberades i en tillväxtkammare under 7 dagar.Plantorna fotograferades och rötternas längd mättes.För Arabidopsis grobarhetsanalys såddes 48 frön per platta på agarmedium innehållande 200 μM förening eller DMSO.Arabidopsis-frön odlades i en tillväxtkammare och antalet grodda plantor räknades 7 dagar efter groning (dag).För tobaksgroningsanalys såddes 24 frön per platta på agarmedium innehållande 200 μM KAND eller DMSO.Tobaksfrön odlades i en odlingskammare och antalet grodda plantor räknades efter 14 dagar.För leverörtstillväxtinhiberingsanalysen ströks 9 embryon från varje platta ut på agarmedium innehållande de angivna koncentrationerna av KAND eller DMSO och inkuberades i en tillväxtkammare under 14 dagar.
Använd plantor färgade med 5 mg/ml propidiumjodid (PI) för att visualisera rotmeristems organisation.PI-signaler observerades med fluorescensmikroskopi med användning av ett TCS SPE konfokalt laserskanningsmikroskop (Leica Microsystems).
Histokemisk färgning av rötter med β-glukuronidas (GUS) utfördes enligt protokollet som beskrivs av Malami och Benfey36.Groddplantor fixerades i 90 % aceton över natten, färgades med 0,5 mg/ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-p-d-glukuronsyra i GUS-buffert under 1 timme och placerades i en hydratiserad kloraldehydlösning.(8 g kloralhydrat, 2 ml vatten och 1 ml glycerol) och observerades med differentiell interferenskontrastmikroskopi med ett Axio Imager M1-mikroskop (Carl Zeiss).
Rotvinklar mättes på 7 dagar gamla plantor odlade på vertikalt placerade plattor.Mät vinkeln på roten från gravitationsvektorns riktning enligt beskrivningen i steg 6.
Arrangemanget av kortikala mikrotubuli observerades enligt beskrivningen, med mindre modifieringar av protokollet 37 .Anti-β-tubulin antikropp (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) och Alexa Fluor 488-konjugerad anti-mus IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) användes som primära och sekundära antikroppar vid 1:1000 och 1:100 spädningar, respektive.Fluorescensbilder togs med ett TCS SPE konfokalt laserskanningsmikroskop (Leica Microsystems).Skaffa Z-stack-bilder och skapa projektioner med maximal intensitet enligt tillverkarens instruktioner.
HeLa cellproliferationsanalys utfördes med användning av Cell Counting Kit 8 (Dojindo) enligt tillverkarens instruktioner.
Tillväxten av E. coli DH5a analyserades genom att mäta celldensitet i kultur med användning av en spektrofotometer vid 600 nm (OD600).
Cytoskelettorganisation i transgena BY-2-celler observerades med användning av ett fluorescensmikroskop utrustat med en CSU-X1 konfokal skanningsenhet (Yokogawa) och en sCMOS-kamera (Zyla, Andor Technology).Cytoskelettdensitet utvärderades genom bildanalys, som kvantifierade andelen cytoskelettpixlar bland cytoplasmatiska pixlar i konfokala bilder med hjälp av ImageJ-mjukvara som beskrivs38,39.
För att detektera celldöd i BY-2-celler inkuberades en alikvot av cellsuspensionen med 0,05 % Evans blue under 10 minuter vid rumstemperatur.Selektiv Evans blå färgning av döda celler beror på extrudering av färgämnet från livsdugliga celler av det intakta plasmamembranet40.Färgade celler observerades med användning av ett ljusfältsmikroskop (BX53, Olympus).
HeLa-celler odlades i DMEM kompletterat med 10% FBS i en fuktad inkubator vid 37°C och 5% CO2.Celler behandlades med 100 μM KAND 11, kumamonsyra 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) eller 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) i 6 timmar vid 37°C.Celler fixerades med MetOH i 10 minuter och sedan med acetat i 5 minuter vid rumstemperatur.Fixerade celler inkuberades med β-tubulin primär antikropp (1D4A4, Proteintech: 66240-1) utspädd i 0,5% BSA/PBS under 2 timmar, tvättades 3 gånger med TBST och inkuberades sedan med Alexa Fluor getantikropp.488 1 timme.– Mus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) och 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) utspädd i 0,5 % BSA/PBS.Efter tvättning med TBST tre gånger observerades färgade celler på ett Nikon Eclipse Ti-E inverterat mikroskop.Bilderna togs med en kyld Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kamera med hjälp av MetaMorph-mjukvaran (Molecular Devices).
Posttid: 2024-jun-17