Tack för att du besöker Nature.com. Den webbläsarversion du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa resultat rekommenderar vi att du använder en nyare version av din webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, visar vi webbplatsen utan styling eller JavaScript.
Upptäckten och den gynnsamma användningen av naturprodukter kan bidra till att förbättra människors liv. Växttillväxthämmande kemikalier används ofta som herbicider för att bekämpa ogräs. På grund av behovet av att använda olika typer av herbicider finns det ett behov av att identifiera föreningar med nya verkningsmekanismer. I denna studie upptäckte vi en ny N-alkoxipyrrolförening, kumamonamid, från Streptomyces werraensis MK493-CF1 och etablerade den fullständiga syntesprocessen. Genom biologiska aktivitetsanalyser upptäckte vi att urs-monoaminsyra är en syntetisk intermediär av urs-monoamid och en potentiell...växttillväxthämmareDessutom har vi utvecklat olika urbenonsyraderivat, inklusive urbenyloxiderivatet (UDA), som har hög herbicid aktivitet utan att negativt påverka tillväxten av HeLa-celler. Vi fann också att urmotonsyraderivat stör växternas mikrotubuli; dessutom påverkar KAND aktinfilament och inducerar celldöd; Dessa mångfacetterade effekter skiljer sig från de hos kända mikrotubuli-hämmare och tyder på en ny verkningsmekanism för ursonsyra, vilket representerar en viktig fördel vid utvecklingen av nya herbicider.
Upptäckten och den praktiska tillämpningen av nyttiga naturprodukter och deras derivat är ett sätt att förbättra människors livskvalitet. Sekundära metaboliter som produceras av mikroorganismer, växter och insekter har lett till stora framsteg inom medicin och jordbruk. Många antibiotika och läkemedel mot leukemi har utvecklats från naturprodukter. Dessutom finns det olika typer avbekämpningsmedel, fungicider och herbicider utvinns från dessa naturprodukter för användning inom jordbruket. I synnerhet är ogräsbekämpningsherbicider viktiga verktyg för att öka skördarna i modernt jordbruk, och olika typer av föreningar används redan kommersiellt. Flera cellulära processer i växter, såsom fotosyntes, aminosyrametabolism, cellväggssyntes, reglering av mitos, fytohormonsignalering eller proteinsyntes, anses vara typiska mål för herbicider. Föreningar som hämmar mikrotubulifunktionen är en vanlig klass av herbicider som påverkar växttillväxt genom att påverka mitosregleringen.
Mikrotubuli är komponenter i cytoskelettet och är i stor utsträckning konserverade i eukaryota celler. Tubulinheterodimeren består av α-tubulin och β-tubulin och bildar linjära mikrotubuliprotofilament, med 13 protofilament som bildar en cylindrisk struktur. Mikrotubuli spelar flera roller i växtceller, inklusive att bestämma cellform, celldelning och intracellulär transport3,4. Växtceller innehåller mikrotubuli under interfasens plasmamembran, och dessa så kallade kortikala mikrotubuli tros kontrollera organisationen av cellulosamikrofibriller genom reglering av cellulosasyntaskomplex4,5. Kortikala mikrotubuli i rotens epidermala celler, som finns i zonen för snabb förlängning av rotspetsen, är belägna lateralt, och cellulosamikrofibrer följer dessa mikrotubuli och begränsar riktningen för cellexpansion, vilket främjar anisotropisk cellförlängning. Därför är mikrotubulifunktionen nära relaterad till växtens morfologi. Aminosyrasubstitutioner i gener som kodar för tubulin orsakar snedvridning av kortikala mikrotubuli-matriser och vänster- eller högersidig tillväxt hos Arabidopsis 6,7. På liknande sätt kan mutationer i mikrotubuli-associerade proteiner som reglerar mikrotubulidynamiken också leda till förvrängd rottillväxt 8,9,10,11,12,13. Dessutom orsakar behandling med mikrotubulistörande herbicider såsom disopyramid, även känt som pretilaklor, också vänstersidig sned rottillväxt 14. Dessa data indikerar att exakt reglering av mikrotubulifunktionen är avgörande för att bestämma växternas tillväxtriktning.
Olika typer av mikrotubuli-hämmare har upptäckts, och dessa läkemedel har bidragit betydande till cytoskelettforskning, såväl som till jordbruk och medicin2. I synnerhet kan oryzalin, dinitroanilinföreningar, disopyramid, bensamidrelaterade föreningar och deras analoger hämma mikrotubulifunktionen och därigenom hämma växttillväxt. Därför används de i stor utsträckning som herbicider. Eftersom mikrotubuli är en viktig komponent i växt- och djurceller är de flesta mikrotubuli-hämmare cytotoxiska för båda celltyperna. Trots deras erkända användbarhet som herbicider används därför ett begränsat antal antimikrotubuli-medel för praktiska ändamål.
Streptomyces är ett släkte i familjen Streptomyces, som inkluderar aeroba, grampositiva, filamentösa bakterier och är allmänt känt för sin förmåga att producera ett brett spektrum av sekundära metaboliter. Därför anses det vara en av de viktigaste källorna till nya biologiskt aktiva naturprodukter. I den aktuella studien upptäckte vi en ny förening som kallas kumamonamid, som isolerades från Streptomyces werraensis MK493-CF1 och S. werraensis ISP 5486. Med hjälp av spektralanalys och fullständig spektralanalys karakteriserades strukturen hos kumamonamid och dess unika N-alkoxipyrrolskelett bestämdes. Ursmonsyra, en syntetisk intermediär av ursmonoamid och dess derivat, visade sig hämma tillväxten och groningen hos den populära modellväxten Arabidopsis thaliana. I en struktur-aktivitetsförhållandestudie fann vi att en förening med C9 modifierad till ursonsyra, kallad nonyloxiderivat av ursonsyra (KAND), signifikant förstärker den hämmande effekten på tillväxt och groning. Det är värt att notera att den nyupptäckta växttillväxthämmaren även påverkade tillväxten av tobak och levermossa och inte var cytotoxisk för bakterier eller HeLa-celler. Dessutom inducerar vissa urmotonsyraderivat en förvrängd rotfenotyp, vilket antyder att dessa derivat direkt eller indirekt påverkar mikrotubuli. I överensstämmelse med denna idé indikerar våra observationer av mikrotubuli märkta antingen immunhistokemiskt eller med fluorescerande proteiner att KAND-behandling depolymeriserar mikrotubuli. Dessutom störde behandling med kumamotonsyraderivat aktinmikrofilament. Således har vi upptäckt en ny växttillväxthämmare vars unika verkningsmekanism involverar förstörelse av cytoskelettet.
Stammen MK493-CF1 isolerades från jord i Shinagawa-ku, Tokyo. Stammen MK493-CF1 bildade ett välgrenat stromalt mycel. Den partiella sekvensen av 16S ribosomalt RNA-genen (1422 bp) bestämdes. Denna stam är mycket lik S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typisk stam, 99,93%). Baserat på detta resultat fastställdes att denna stam var nära besläktad med typstammen av S. werraensis. Därför döpte vi preliminärt denna stam till S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T producerar också samma bioaktiva föreningar. Eftersom det fanns lite tidig forskning om att utvinna naturliga produkter från denna mikroorganism, utfördes ytterligare kemisk forskning. Efter odling av S. werraensis MK493-CF1 på kornmedium genom fastfasjäsning vid 30 °C i 14 dagar extraherades mediet med 50 % EtOH. 60 ml prov torkades för att erhålla 59,5 mg råextrakt. Råextraktet utsattes för omvänd fas-HPLC för att ge N-metoxi-1H-pyrrol-2-karboxamid (1, kallad kumamonamid, 36,0 mg). Den totala mängden 1 är cirka 60 % av råextraktet. Därför beslutade vi att studera egenskaperna hos kumamotoamid 1 i detalj.
Kumamonamid 1 är ett vitt amorft pulver och högupplösande masspektrometri (HRESIMS) bekräftar C6H8N2O2 (Fig. 1). Det C2-substituerade pyrrolfragmentet av denna förening kännetecknas av δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH i 1H NMR-spektrum: 4,5 Hz, H-5) och δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), och 13C NMR-spektrumet visar närvaron av fyra sp2-kolatomer. Närvaron av en amidgrupp vid C2-positionen bedömdes genom HMBC-korrelation från C-3-protonen till amidkarbonylkolatomen vid δC 161,1. Dessutom indikerar 1H- och 13C-NMR-toppar vid δH 4,10 (3H, S) och δC 68,3 närvaron av N-metoxigrupper i molekylen. Även om metoxigruppens korrekta position ännu inte hade bestämts med hjälp av spektroskopisk analys såsom förbättrad differensspektroskopi och nukleär Overhauser-förkortning (NOEDF), blev N-metoxi-1H-pyrrol-2-karboxamid den första kandidatföreningen.
För att bestämma den korrekta strukturen för 1 utfördes en totalsyntes (Fig. 2a). Behandling av kommersiellt tillgänglig 2-aminopyridin 2 med m-CPBA resulterade i motsvarande N-oxid 3 i kvantitativt utbyte. Efter 2-aminoazidering av 2 utfördes cyklokondensationsreaktionen som beskrivs av Abramovich i bensen vid 90°C för att erhålla den önskade 1-hydroxi-1H-pyrrol-2-karbonitril 5 i gram. Hastighet 60% (två steg). 15,16. Metylering och hydrolys av 4 gav sedan 1-metoxi-1H-pyrrol-2-karboxylsyra (benämnd "kumotonsyra", 6) i gott utbyte (70%, två steg). Slutligen gav amidering via syrakloridintermediär 6 med användning av vattenhaltig ammoniak Kumamoto-amid 1 i 98% utbyte. Alla spektraldata för syntetiserad 1 liknade den för isolerad 1, så strukturen för 1 bestämdes;
Allmän syntes och analys av den biologiska aktiviteten hos urbenamid och urbensyra. (a) Total syntes av Kumamoto-amid. (b) Sju dagar gamla vildtypsplantor av Arabidopsis Columbia (Col) odlades på Murashige och Skoog (MS)-plattor innehållande kumamonamid 6 eller kumamonamid 1 vid de angivna koncentrationerna. Skalstreck = 1 cm.
Först utvärderade vi de biologiska aktiviteterna hos urbenamid och dess intermediärer för deras förmåga att modulera växttillväxt. Vi tillsatte olika koncentrationer av ursmonamid 1 eller ursonsyra 6 till MS-agarmedium och odlade Arabidopsis thaliana-plantor på detta medium. Dessa analyser visade att höga koncentrationer (500 μM) av 6 hämmade rottillväxt (Fig. 2b). Därefter genererade vi olika derivat genom att ersätta N1-positionen av 6 och utförde struktur-aktivitetsförhållandestudier på dem (den analoga syntesprocessen beskrivs i den kompletterande informationen (SI)). Arabidopsis-plantor odlades på ett medium innehållande 50 μM ursonsyraderivat, och rotlängden mättes, som visas på bilden. Som visas i figur 3a, b och S1 har kumamosyror olika längder av linjära alkoxikedjor (9, 10, 11, 12 och 13) eller stora alkoxikedjor (15, 16 och 17) vid N1-positionen. Derivaten visade signifikant hämning av rottillväxt. Dessutom fann vi att applicering av 200 μM 10, 11 eller 17 hämmade groning (fig. 3c och S2).
Studie av struktur-aktivitetsförhållandet för Kumamoto-amid och besläktade föreningar. (a) Struktur- och syntesschema för analoger. (b) Kvantifiering av rotlängden hos 7 dagar gamla plantor odlade på MS-medium med eller utan 50 μM kumamonamidderivat. Asterisker indikerar signifikanta skillnader med simulerad behandling (t-test, p< 0,05). n>18. Data visas som medelvärde ± standardavvikelse. nt betyder "ej testad" eftersom mer än 50 % av fröna inte grodde. (c) Kvantifiering av groningshastigheten för behandlade frön inkuberade i 7 dagar i MS-medium med eller utan 200 μM kumamonamid och relaterade föreningar. Asterisker indikerar signifikanta skillnader med simulerad behandling (chi-kvadrattest). n=96.
Intressant nog minskade tillsatsen av alkylsidokedjor längre än C9 den hämmande aktiviteten, vilket tyder på att kumamotosyrarelaterade föreningar kräver sidokedjor av en viss storlek för att uppvisa sin biologiska aktivitet.
Eftersom analys av struktur-aktivitetsförhållandet visade att C9 modifierades till ursonsyra och att nonyloxiderivatet av ursonsyra (nedan kallat KAND 11) var den mest effektiva växttillväxthämmaren, utförde vi en mer detaljerad karakterisering av KAND 11. Behandling av Arabidopsis med 50 μM KAND 11 förhindrade nästan fullständigt groning, medan lägre koncentrationer (40, 30, 20 eller 10 μM) av KAND 11 hämmade rottillväxt på ett dosberoende sätt (Fig. 4a, b). För att testa om KAND 11 påverkar rotmeristemens livskraft undersökte vi rotmeristemer färgade med propidiumjodid (PI) och mätte meristemareans storlek. Meristemets storlek hos plantor odlade på ett medium innehållande 25 μM KAND-11 var 151,1 ± 32,5 μm, medan meristemets storlek hos plantor odlade på ett kontrollmedium innehållande DMSO var 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), vilket indikerar att KAND-11 återställer cellaktiviteten. Rotmeristem. I överensstämmelse med detta minskade KAND 11-behandling mängden celldelningsmarkören CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-signal i rotmeristemet (Fig. 4e)17. Dessa resultat indikerar att KAND 11 hämmar rottillväxt genom att minska cellproliferationsaktiviteten.
Analys av den hämmande effekten av urbenonsyraderivat (urbenyloxiderivat) på tillväxt. (a) 7 dagar gamla vildtyps-Col-plantor odlade på MS-plattor med de angivna koncentrationerna av KAND 11. Skalstreck = 1 cm. (b) Kvantifiering av rotlängd. Bokstäver indikerar signifikanta skillnader (Tukey HSD-test, p< 0,05). n>16. Data visas som medelvärde ± standardavvikelse. (c) Konfokalmikroskopi av propidiumjodidfärgade vildtyps-Col-rötter odlade på MS-plattor med eller utan 25 μM KAND 11. Vita parenteser indikerar rotmeristem. Skalstreck = 100 µm. (d) Kvantifiering av rotmeristemstorlek (n = 10 till 11). Statistiska skillnader bestämdes med hjälp av t-test (p< 0,05). Staplarna representerar den genomsnittliga meristemstorleken. (e) Differentialinterferenskontrastmikroskopi (DIC) av ett rotmeristem innehållande CDKB2-konstruktionen; 1pro: CDKB2; 1-GUS färgat och färgat på 5 dagar gamla plantor odlade på MS-plattor med eller utan 25 µM KAND-analys.
Fytotoxiciteten hos KAND 11 testades vidare med en annan tvåhjärtbladig växt, tobak (Nicotiana tabacum), och en viktig modellorganism för landväxter, levermossa (Marchantia polymorpha). Liksom i fallet med Arabidopsis producerade tobaksplantor av SR-1 som odlats på medium innehållande 25 μM KAND 11 kortare rötter (Fig. 5a). Dessutom grodde 40 av 48 frön på plattor innehållande 200 μM KAND 11, medan alla 48 frön grodde på simulerat behandlat medium, vilket indikerar att högre koncentrationer av KAND var signifikanta (p< 0,05; chi-test -kvadrat) hämmade tobakens groning. (Fig. 5b). Dessutom var koncentrationen av KAND 11 som hämmade bakterietillväxt i levermossa lik den effektiva koncentrationen i Arabidopsis (Fig. 5c). Dessa resultat indikerar att KAND 11 kan hämma tillväxten av en mängd olika växter. Vi undersökte sedan den möjliga cytotoxiciteten hos björnmonoamidrelaterade föreningar i andra organismer, nämligen humana HeLa-celler och Escherichia coli-stammen DH5α, som representanter för högre djur- respektive bakterieceller. I en serie cellproliferationsanalyser observerade vi att kumamonamid 1, kumamonamidsyra 6 och KAND 11 inte påverkade tillväxten av HeLa- eller E. coli-celler vid koncentrationer på 100 μM (Fig. 5d,e).
Tillväxthämning av KAND 11 i icke-Arabidopsis-organismer. (a) Två veckor gamla vildtyp SR-1-tobaksplantor odlades på vertikalt placerade MS-plattor innehållande 25 μM KAND 11. (b) Två veckor gamla vildtyp SR-1-tobaksplantor odlades på horisontellt placerade MS-plattor innehållande 200 μM KAND 11. (c) Två veckor gamla vildtyp Tak-1-levermossknoppar odlade på Gamborg B5-plattor med de angivna koncentrationerna av KAND 11. Röda pilar indikerar sporer som slutade växa inom den två veckor långa inkubationsperioden. (d) Cellproliferationsanalys av HeLa-celler. Antalet livskraftiga celler mättes vid fasta tidsintervall med hjälp av ett cellräkningskit 8 (Dojindo). Som kontroll behandlades HeLa-celler med 5 μg/ml aktinomycin D (Act D), vilket hämmar RNA-polymeras-transkription och orsakar celldöd. Analyser utfördes i triplikat. (e) E. coli-cellproliferationsanalys. E. coli-tillväxt analyserades genom att mäta OD600. Som kontroll behandlades cellerna med 50 μg/ml ampicillin (Amp), vilket hämmar syntesen av bakteriecellväggar. Analyserna utfördes i triplikat.
För att dechiffrera verkningsmekanismen för cytotoxicitet orsakad av uramidrelaterade föreningar, analyserade vi om urbensyraderivat med måttliga hämmande effekter, som visas på bilden. Som visas i figur 2b, 6a producerade plantor odlade på agarplattor innehållande höga koncentrationer (200 μM) urmotonsyra 6 kortare och vänsterböjda rötter (θ = – 23,7 ± 6,1), medan plantor odlade på kontrollmediet producerade nästan raka rötter (θ = – 3,8 ± 7,1). Denna karakteristiska sneda tillväxt är känd för att bero på dysfunktion av kortikala mikrotubuli 14,18. I överensstämmelse med detta fynd inducerade de mikrotubuli-destabiliserande läkemedlen disopyramid och oryzalin liknande rotlutning under våra tillväxtförhållanden (fig. 2b, 6a). Samtidigt testade vi urmotonsyraderivat och valde ut flera av dem som, vid vissa koncentrationer, inducerade sned rottillväxt. Föreningarna 8, 9 och 15 ändrade rottillväxtriktningen vid 75 μM, 50 μM respektive 40 μM, vilket indikerar att dessa föreningar effektivt kan destabilisera mikrotubuli (Fig. 2b, 6a). Vi testade också det mest potenta ursolsyraderivatet, KAND 11, vid en lägre koncentration (15 μM) och fann att applicering av KAND 11 hämmade rottillväxten och att rottillväxtriktningen var ojämn, även om de tenderade att luta åt vänster (Figur C3). Eftersom högre koncentrationer av mikrotubuli-destabiliserande läkemedel ibland hämmar växttillväxt snarare än att orsaka rotlutning, bedömde vi därefter möjligheten att KAND 11 påverkar mikrotubuli genom att observera kortikala mikrotubuli i rotens epidermala celler. Immunohistokemi med användning av anti-β-tubulin-antikroppar i epidermala celler från plantrötter behandlade med 25 μM KAND 11 visade försvinnandet av nästan alla kortikala mikrotubuli i epidermala celler i förlängningszonen (Fig. 6b). Dessa resultat indikerar att kumamotonsyra och dess derivat verkar direkt eller indirekt på mikrotubuli för att störa dem och att dessa föreningar är nya mikrotubuli-hämmare.
Ursonsyra och dess derivat förändrar kortikala mikrotubuli i Arabidopsis thaliana. (a) Rotlutningsvinkel mätt i närvaro av olika urmonsyraderivat vid de angivna koncentrationerna. Effekterna av två föreningar som är kända för att hämma mikrotubuli: disopyramid och oryzalin analyserades också. Insatsen visar standarden som används för att mäta rottillväxtvinkeln. Asterisker indikerar signifikanta skillnader med simulerad behandling (t-test, p< 0,05). n>19. Skalstreck = 1 cm. (b) Kortikala mikrotubuli i epidermala celler i elongationszonen. Mikrotubuli i vildtypsrötter av Arabidopsis Col odlade på MS-plattor med eller utan 25 μM KAND 11 visualiserades genom immunhistokemisk färgning med primära β-tubulin-antikroppar och Alexa Fluor-konjugerade sekundära antikroppar. Skalstreck = 10 µm. (c) Mitotisk struktur av mikrotubuli i rotmeristemet. Mikrotubuli visualiserades med immunhistokemisk färgning. Mitotiska strukturer, inklusive profaszoner, spindlar och fragmoplaster, räknades från konfokala bilder. Pilar indikerar mitotiska mikrotubulistrukturer. Asterisker indikerar signifikanta skillnader med simulerad behandling (t-test, p< 0,05). n>9. Skalstreck = 50 µm.
Även om Ursa har förmågan att störa mikrotubulifunktionen, förväntas dess verkningsmekanism skilja sig från typiska mikrotubuli-depolymeriserande medel. Till exempel inducerar högre koncentrationer av mikrotubuli-depolymeriserande medel såsom disopyramid och oryzalin anisotrop expansion av epidermala celler, medan KAND 11 inte gör det. Dessutom resulterade samtidig applicering av KAND 11 och disopyramid i ett kombinerat disopyramidinducerat rottillväxtsvar och KAND 11-inducerad tillväxthämning observerades (Fig. S4). Vi analyserade också svaret hos den överkänsliga disopyramid 1-1 (phs1-1) mutanten på KAND 11. phs1-1 har en icke-kanonisk tubulinkinaspunktmutation och producerar kortare rötter vid behandling med disopyramid9,20. phs1-1-mutantplantor odlade på agarmedium innehållande KAND 11 hade kortare rötter liknande de som odlats på disopyramid (fig. S5).
Dessutom observerade vi mitotiska mikrotubulistrukturer, såsom profaszoner, spindlar och fragmoplaster, i rotmeristemet hos plantor behandlade med KAND 11. I överensstämmelse med observationerna för CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS observerades en signifikant minskning av antalet mitotiska mikrotubuli (Fig. .6c).
För att karakterisera cytotoxiciteten hos KAND 11 vid subcellulär upplösning behandlade vi tobaks BY-2-suspensionsceller med KAND 11 och observerade deras respons. Vi tillsatte först KAND 11 till BY-2-celler som uttrycker TagRFP-TUA6, som fluorescerande märker mikrotubuli, för att bedöma effekten av KAND 11 på kortikala mikrotubuli. Kortikal mikrotubuli-densitet bedömdes med hjälp av bildanalys, som kvantifierade andelen cytoskelettala pixlar bland cytoplasmatiska pixlar. Analysresultaten visade att efter behandling med 50 μM eller 100 μM KAND 11 i 1 timme minskade densiteten signifikant till 0,94 ± 0,74 % respektive 0,23 ± 0,28 %, medan densiteten hos celler behandlade med DMSO uppgick till 1,61 ± 0,34 % (Fig. 7a). Dessa resultat överensstämmer med observationen i Arabidopsis att KAND 11-behandling inducerar depolymerisering av kortikala mikrotubuli (Fig. 6b). Vi undersökte även BY-2-linjen med GFP-ABD-märkta aktinfilament efter behandling med samma koncentration av KAND 11 och observerade att KAND 11-behandling störde aktinfilamenten. Behandling med 50 μM eller 100 μM KAND 11 i 1 timme minskade signifikant aktinfilamentdensiteten till 1,20 ± 0,62 % respektive 0,61 ± 0,26 %, medan densiteten i DMSO-behandlade celler var 1,69 ± 0,51 % (Fig. 2). 7b). Dessa resultat står i kontrast till effekterna av propyzamid, som inte påverkar aktinfilament, och latrunkulin B, en aktindepolymerisator som inte påverkar mikrotubuli (SI Figur S6). Dessutom påverkade behandling med kumamonamid 1, kumamonamidsyra 6 eller KAND 11 inte mikrotubuli i HeLa-celler (SI Figur S7). Således tros verkningsmekanismen för KAND 11 skilja sig från den för kända cytoskelettstörare. Dessutom avslöjade vår mikroskopiska observation av BY-2-celler behandlade med KAND 11 att celldöd började under KAND 11-behandling och visade att andelen Evans-blåfärgade döda celler inte ökade signifikant efter 30 minuters KAND 11-behandling, medan antalet döda celler efter 90 minuters behandling med 50 μM respektive 100 μM KAND ökade till 43,7 % respektive 80,1 % (Fig. 7c). Sammantaget indikerar dessa data att det nya ursolsyraderivatet KAND 11 är en växtspecifik cytoskeletthämmare med en tidigare okänd verkningsmekanism.
KAND påverkar kortikala mikrotubuli, aktinfilament och viabiliteten hos tobaks BY-2-celler. (a) Visualisering av kortikala mikrotubuli i BY-2-celler i närvaro av TagRFP-TUA6. BY-2-celler behandlade med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO undersöktes med konfokalmikroskopi. Kortikal mikrotubuli-densitet beräknades från mikrofotografier av 25 oberoende celler. Bokstäver indikerar signifikanta skillnader (Tukey HSD-test, p< 0,05). Skalstreck = 10 µm. (b) Kortikala aktinfilament i BY-2-celler visualiserade i närvaro av GFP-ABD2. BY-2-celler behandlade med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO undersöktes med konfokalmikroskopi. Tätheten av kortikala aktinfilament beräknades från mikrofotografier av 25 oberoende celler. Bokstäver indikerar signifikanta skillnader (Tukey HSD-test, p< 0,05). Skalstreck = 10 µm. (c) Observation av döda BY-2-celler med Evans blåfärgning. BY-2-celler behandlade med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO undersöktes med ljusfältsmikroskopi. n=3. Skalstreck = 100 µm.
Upptäckten och tillämpningen av nya naturprodukter har lett till betydande framsteg inom olika aspekter av mänskligt liv, inklusive medicin och jordbruk. Historisk forskning har utförts för att utvinna användbara föreningar från naturresurser. I synnerhet är aktinomyceter kända för att vara användbara som antiparasitiska antibiotika för nematoder på grund av deras förmåga att producera olika sekundära metaboliter såsom avermektin, den ledande föreningen i ivermektin och bleomycin och dess derivat, som används medicinskt som ett anticancermedel21,22. Likaså har en mängd olika herbicida föreningar upptäckts från aktinomyceter, av vilka några redan används kommersiellt1,23. Därför anses analys av aktinomycetmetaboliter för att isolera naturprodukter med önskad biologisk aktivitet vara en effektiv strategi. I denna studie upptäckte vi en ny förening, kumamonamid, från S. werraensis och syntetiserade den framgångsrikt. Ursonsyra är en syntetisk intermediär av urbenamid och dess derivat. Den kan orsaka karakteristisk rotkrullning, uppvisa måttlig till stark herbicid aktivitet och direkt eller indirekt skada växtmikrotubuli. Emellertid kan verkningsmekanismen för urmotonsyra skilja sig från den för befintliga mikrotubuli-hämmare, eftersom KAND 11 också stör aktinfilament och orsakar celldöd, vilket tyder på en regleringsmekanism genom vilken urmotonsyra och dess derivat påverkar ett brett spektrum av cytoskelettala strukturer.
Ytterligare detaljerad karakterisering av urbenonsyra kommer att bidra till att bättre förstå verkningsmekanismen för urbenonsyra. Nästa mål är att utvärdera ursonsyrans förmåga att binda till reducerade mikrotubuli för att avgöra om ursonsyra och dess derivat verkar direkt på mikrotubuli och depolymeriserar dem, eller om deras verkan resulterar i destabilisering av mikrotubuli. I de fall där mikrotubuli inte är ett direkt mål, kommer identifiering av verkningsstället och molekylära mål för ursonsyra på växtceller att bidra till att ytterligare förstå egenskaperna hos relaterade föreningar och möjliga sätt att förbättra herbicidaktiviteten. Vår bioaktivitetsanalys avslöjade den unika cytotoxiska förmågan hos ursonsyra på tillväxten av växter som Arabidopsis thaliana, tobak och levermossa, medan varken E. coli eller HeLa-celler påverkades. Liten eller ingen toxicitet för djurceller är en fördel med ursonsyraderivat om de utvecklas som herbicider för användning på öppna jordbruksfält. Eftersom mikrotubuli är vanliga strukturer i eukaryoter är deras selektiva hämning i växter ett viktigt krav för herbicider. Till exempel används propyzamid, ett mikrotubuli-depolymeriserande medel som binder direkt till tubulin och hämmar polymerisation, som herbicid på grund av dess låga toxicitet för djurceller24. Till skillnad från disopyramid har besläktade bensamider olika målspecificiteter. Förutom växtmikrotubuli hämmar RH-4032 eller bensoxamid även mikrotubuli i djurceller respektive oomyceter, och zalilamid används som fungicid på grund av dess låga fytotoxicitet25,26,27. Den nyupptäckta björnen och dess derivat uppvisar selektiv cytotoxicitet mot växter, men det är värt att notera att ytterligare modifieringar kan förändra deras målspecificitet, vilket potentiellt kan ge ytterligare derivat för bekämpning av patogena svampar eller oomyceter.
De unika egenskaperna hos urbenonsyra och dess derivat är användbara för deras utveckling som herbicider och användning som forskningsverktyg. Cytoskelettets betydelse för att kontrollera växtcellernas form är allmänt erkänd. Tidigare studier har visat att växter har utvecklat komplexa mekanismer för kortikala mikrotubuliorganisation genom att kontrollera mikrotubulidynamiken för att korrekt kontrollera morfogenesen. Ett stort antal molekyler som ansvarar för regleringen av mikrotubuliaktivitet har identifierats, och relaterad forskning pågår fortfarande3,4,28. Vår nuvarande förståelse av mikrotubulidynamik i växtceller förklarar inte helt mekanismerna för kortikala mikrotubuliorganisation. Till exempel, även om både disopyramid och oryzalin kan depolymerisera mikrotubuli, orsakar disopyramid allvarlig rotförvrängning medan oryzalin har en relativt mild effekt. Dessutom orsakar mutationer i tubulin, som stabiliserar mikrotubuli, också dextrorotation i rötter, medan paklitaxel, som också stabiliserar mikrotubulidynamiken, inte gör det. Därför bör studier och identifiering av de molekylära målen för ursolsyra ge nya insikter i regleringen av växternas kortikala mikrotubuli. Likaså kommer framtida jämförelser av kemikalier som är effektiva för att främja förvrängd tillväxt, såsom disopyramid, och mindre effektiva kemikalier, såsom oryzalin eller kumamotorsyra, att ge ledtrådar till hur förvrängd tillväxt uppstår.
Å andra sidan är försvarsrelaterade cytoskelettala omarrangemang en annan möjlighet att förklara ursonsyrans cytotoxicitet. Infektion av en patogen eller införande av en elicitor i växtceller orsakar ibland förstörelse av cytoskelettet och efterföljande celldöd29. Till exempel har oomycet-deriverat kryptoxantin rapporterats störa mikrotubuli och aktinfilament före tobakscelldöd, liknande vad som sker med KAND-behandling30,31. Likheterna mellan försvarssvar och cellulära svar inducerade av ursonsyra ledde oss till hypotesen att de utlöser vanliga cellulära processer, även om en snabbare och starkare effekt av ursonsyra än kryptoxantin är uppenbar. Studier har dock visat att störning av aktinfilament främjar spontan celldöd, vilket inte alltid åtföljs av mikrotubulistörningar29. Dessutom återstår det att se om antingen patogenen eller elicitorn orsakar förvrängd rottillväxt, som ursonsyraderivat gör. Således är molekylär kunskap som kopplar samman försvarssvar och cytoskelettet ett attraktivt problem att ta itu med. Genom att utnyttja närvaron av lågmolekylära föreningar relaterade till ursonsyra, såväl som en rad derivat med varierande potens, kan de ge möjligheter att rikta in sig på okända cellulära mekanismer.
Sammantaget kommer upptäckten och tillämpningen av nya föreningar som modulerar mikrotubulidynamiken att ge kraftfulla metoder för att hantera de komplexa molekylära mekanismerna som ligger bakom bestämning av växtcellers form. I detta sammanhang kan den nyligen utvecklade föreningen urmotonsyra, som påverkar mikrotubuli och aktinfilament och inducerar celldöd, ge en möjlighet att tyda sambandet mellan mikrotubulikontroll och dessa andra mekanismer. Således kommer kemisk och biologisk analys med urbenonsyra att hjälpa oss att förstå de molekylära regleringsmekanismer som kontrollerar växtens cytoskelett.
Inokulera S. werraensis MK493-CF1 i en 500 ml baffelförsedd Erlenmeyerkolv innehållande 110 ml frömedium bestående av 2 % (w/v) galaktos, 2 % (w/v) essenspasta, 1 % (w/v) Bacto-komposition. -soja (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (w/v) majsextrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2 % (w/v) (NH4)2SO4 och 0,2 % CaCO3 i avjoniserat vatten. (pH 7,4 före sterilisering). Frökulturerna inkuberades på en rotationsskak (180 rpm) vid 27 °C i 2 dagar. Produktionsodling via fastfasjäsning. Frökulturen (7 ml) överfördes till en 500 ml K-1-kolv innehållande 40 g produktionsmedium bestående av 15 g pressat korn (MUSO Co., Ltd., Japan) och 25 g avjoniserat vatten (pH-värdet justerades inte före sterilisering). Fermenteringen utfördes vid 30 °C i mörker i 14 dagar. Fermenteringsmaterialet extraherades med 40 ml EtOH/flaska och centrifugerades (1500 g, 4 °C, 10 min). Kultursupernatanten (60 ml) extraherades med en blandning av 10 % MeOH/EtOAc. Det organiska skiktet indunstades under reducerat tryck för att erhålla en återstod (59,5 mg), vilken utsattes för HPLC med gradienteluering (0–10 minuter: 90 %) på en omvänd faskolonn (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × längd 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuter: 90 % H2O/CH3CN till 70 % H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minuter: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minuter: 90 % H2O/EtOH till 100 % EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100 % EtOH) vid en flödeshastighet av 1,5 ml/min. Kumamonamid (1, 36,0 mg) isolerades som ett vitt amorft pulver.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ beräknat värde: 141,0659, uppmätt värde: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia-frön (Col-0) erhölls från Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) med tillstånd för forskningsbruk. Col-0-frön förökades och vårdades under våra laboratorieförhållanden och användes som vildtyps-Arabidopsis-plantor. Arabidopsis-frön ytsteriliserades och odlades i halvstyrka Murashige och Skoog-medium innehållande 2 % sackaros (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (vikt/volym) 2-(4-morfolino)etansulfonsyra (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) och 1,5 % agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, vid 23 °C och konstant ljus. Frön av phs1-1-mutanten tillhandahölls av T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Frön av stammen SR-1 tillhandahölls av T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) och användes som vildtypstobaksplantor. Tobaksfrön steriliserades på ytan och blötlades i sterilt vatten i tre nätter för att främja groning, placerades sedan i en halvstyrkelösning innehållande 2 % sackaros, 0,05 % (vikt/volym) MES och 0,8 % gellangummi (Fujifilm Wako Pure Chemical, Murashige och Skoog-medium) med pH 5,7 och inkuberades vid 23 °C under konstant ljus.
Stammen Tak-1 tillhandahölls av T. Kohchi (Kyoto University) och användes som standard experimentell enhet för levermossstudien. Gemma erhölls från steriliserade odlade växter och placerades sedan på Gamborg B5-medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) innehållande 1 % sackaros och 0,3 % gellangummi och inkuberades vid 23 °C under kontinuerligt ljus.
Tobaks BY-2-celler (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) tillhandahölls av S. Hasezawa (University of Tokyo). BY-2-celler späddes 95-faldigt i modifierat Linsmeier- och Skoog-medium och kompletterades varje vecka med 2,4-diklorofenoxiättiksyra 32. Cellsuspensionen blandades på en rotationsskakmaskin vid 130 rpm vid 27 °C i mörker. Tvätta cellerna med 10 gånger volymen färskt medium och resuspendera i samma medium. BY-2-transgena cellinjer som stabilt uttrycker mikrotubulimarkören TagRFP-TUA6 eller aktinfilamentmarkören GFP-ABD2 under blomkålsmosaikvirus 35S-promotorn genererades enligt beskrivning 33, 34, 35. Dessa cellinjer kan underhållas och synkroniseras med hjälp av procedurer som liknar de som används för den ursprungliga BY-2-cellinjen.
HeLa-celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) (Life Technologies) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum, 1,2 U/ml penicillin och 1,2 μg/ml streptomycin i en 37 °C inkubator med 5 % CO2.
Alla experiment som beskrivs i detta manuskript utfördes i enlighet med japanska biosäkerhetsföreskrifter och riktlinjer.
Föreningarna löstes i dimetylsulfoxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) som stamlösningar och späddes i MS-medium för Arabidopsis och tobak eller Gamborg B5-medium för levermossa. För rottillväxtinhibitionsanalysen såddes mer än 10 frön per platta på agarmedium innehållande de angivna föreningarna eller DMSO. Fröna inkuberades i en tillväxtkammare i 7 dagar. Plantorna fotograferades och rötternas längd mättes. För Arabidopsis-groningsanalys såddes 48 frön per platta på agarmedium innehållande 200 μM förening eller DMSO. Arabidopsis-frön odlades i en tillväxtkammare och antalet grodda plantor räknades 7 dagar efter groning (dag). För tobaksgroddningsanalys såddes 24 frön per platta på agarmedium innehållande 200 μM KAND eller DMSO. Tobaksfrön odlades i en tillväxtkammare och antalet grodda plantor räknades efter 14 dagar. För analysen av levermoss tillväxthämning placerades 9 embryon från varje platta på agarmedium innehållande de angivna koncentrationerna av KAND eller DMSO och inkuberades i en tillväxtkammare i 14 dagar.
Använd plantor färgade med 5 mg/ml propidiumjodid (PI) för att visualisera rotmeristemorganisationen. PI-signaler observerades med fluorescensmikroskopi med användning av ett TCS SPE konfokallaserskanningsmikroskop (Leica Microsystems).
Histokemisk färgning av rötter med β-glukuronidas (GUS) utfördes enligt protokollet beskrivet av Malami och Benfey36. Plantorna fixerades i 90 % aceton över natten, färgades med 0,5 mg/ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-d-glukuronsyra i GUS-buffert i 1 timme och placerades i en hydratiserad kloraldehydlösning (8 g kloralhydrat, 2 ml vatten och 1 ml glycerol) och observerades med differentiell interferenskontrastmikroskopi med ett Axio Imager M1-mikroskop (Carl Zeiss).
Rotvinklar mättes på 7 dagar gamla plantor som odlats på vertikalt placerade plattor. Mät rotens vinkel från gravitationsvektorns riktning enligt beskrivningen i steg 6.
Arrangemanget av kortikala mikrotubuli observerades enligt beskrivning, med mindre modifieringar av protokollet 37. Anti-β-tubulin-antikropp (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) och Alexa Fluor 488-konjugerad anti-mus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) användes som primära och sekundära antikroppar vid utspädningar 1:1000 respektive 1:100. Fluorescensbilder erhölls med ett TCS SPE konfokallaserskanningsmikroskop (Leica Microsystems). Z-stack-bilder erhölls och projektioner med maximal intensitet skapades enligt tillverkarens instruktioner.
HeLa-cellproliferationsanalys utfördes med Cell Counting Kit 8 (Dojindo) enligt tillverkarens instruktioner.
Tillväxten av E. coli DH5α analyserades genom att mäta celldensiteten i kulturen med hjälp av en spektrofotometer vid 600 nm (OD600).
Cytoskelettal organisation i transgena BY-2-celler observerades med hjälp av ett fluorescensmikroskop utrustat med en CSU-X1 konfokal skanningsenhet (Yokogawa) och en sCMOS-kamera (Zyla, Andor Technology). Cytoskelettal densitet bedömdes genom bildanalys, som kvantifierade andelen cytoskelettala pixlar bland cytoplasmatiska pixlar i konfokala bilder med hjälp av ImageJ-programvara enligt beskrivningen38,39.
För att detektera celldöd i BY-2-celler inkuberades en alikvot av cellsuspensionen med 0,05 % Evans-blått i 10 minuter vid rumstemperatur. Selektiv Evans-blåttfärgning av döda celler är beroende av att färgämnet extruderas från livskraftiga celler av det intakta plasmamembranet40. Färgade celler observerades med hjälp av ett ljusfältsmikroskop (BX53, Olympus).
HeLa-celler odlades i DMEM kompletterat med 10 % FBS i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2. Cellerna behandlades med 100 μM KAND 11, kumamonaminsyra 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml kolcemid (Gibco) eller 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) i 6 timmar vid 37 °C. Cellerna fixerades med MetOH i 10 minuter och sedan med acetat i 5 minuter vid rumstemperatur. Fixerade celler inkuberades med β-tubulin primär antikropp (1D4A4, Proteintech: 66240-1) utspädd i 0,5 % BSA/PBS i 2 timmar, tvättades 3 gånger med TBST och inkuberades sedan med Alexa Fluor getantikropp. 488 1 timme. – Mus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) och 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) utspädd i 0,5 % BSA/PBS. Efter tvättning med TBST tre gånger observerades färgade celler i ett inverterat Nikon Eclipse Ti-E-mikroskop. Bilder togs med en kyld Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kamera med hjälp av programvaran MetaMorph (Molecular Devices).
Publiceringstid: 17 juni 2024